广西罗非鱼源无乳链球菌耐药性及其四环素耐药基因检测

摘要：【目的】研究分析广西罗非鱼源无乳链球菌的耐药性及其四环素类耐药基因，为指导罗非鱼无乳链球菌病的临床用药和揭示其耐药机制提供参考依据。【方法】采用二倍稀释法测定8种抗生素对广西罗非鱼源无乳链球菌的最小抑菌浓度（MIC），运用PCR检测菌株的四环素类耐药基因（tetM、tetO、tetL和tetS）携带情况，并以体外诱导法测定罗非魚源无乳链球菌对多西环素耐药性的获得速率。【结果】37株广西罗非鱼源无乳链球菌对氨苄青霉素、多西环素、红霉素和土霉素均敏感，对硫酸新霉素和磺胺二甲嘧啶不敏感（已产生耐药性）；仅从8株菌株中检出tetM基因，检出率21.6%（8/37），而tetO、tetL和tetS基因的携带率均为0，即广西罗非鱼源无乳链球菌仅存在tetM+tetO-tetL-tetS-和tetM-tetO-tetL-tetS-两种耐药基因型。经多西环素连续8代的体外传代诱导，6株携带tetM基因的罗非鱼源无乳链球菌MIC由0.24 μg/mL上升至3.91 μg/mL，即耐药性获得速率约16倍。PCR检测结果显示，各传代菌株均携带有tetM基因，且各传代菌株间的核甘酸相似性为100.0%。【结论】广西罗非鱼源无乳链球菌存在tetM+tetO-tetL-tetS-和tetM-tetO-tetL-tetS两种耐药基因型，对氨苄青霉素、多西环素、红霉素和土霉素仍较敏感，对硫酸新霉素和磺胺二甲嘧啶已产生耐药性。携带tetM基因的罗非鱼源无乳链球菌经体外诱导后对多西环素的耐药性大幅度提高，说明未达有效抑菌浓度时极易诱导无乳链球菌产生耐药性。

关键词： 罗非鱼；无乳链球菌；抗生素；耐药性；四环素类耐药基因

中图分类号： S965.125 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）10-2077-10

0 引言

【研究意义】罗非鱼（Oreochromis spp.）具有食性广、生长速度快、抗病能力强等优点（李新，2016），是联合国粮农组织（FAO）向全世界推广养殖的优良水产品种（彭民毅，2014）。广西是我国罗非鱼主产区之一，罗非鱼养殖业已成为广西渔业生产的重要支柱产业。随着养殖密度的增加和规模的扩大，罗非鱼养殖环境也随之恶化，病害逐渐增多，尤其是细菌性疾病给罗非鱼养殖业带来巨大经济损失（柒壮林，2012；彭民毅，2014；高桂生等，2016；吕小丽等，2017）。无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）是罗非鱼养殖过程中危害严重的主要病原菌之一，也是人类和猪、牛等动物的主要致病菌（张宗锋，2012；黄艳华等，2014；郭长明等，2017）。该菌可引起罗非鱼的脑膜炎和败血症（Chu et al.，2016），其临床症状表现为眼球突出、浑浊发白，躯干扭曲，游姿异常等（张新艳等，2008）。在实际生产中，罗非鱼养殖户通常凭经验用药，难免存在盲目使用抗生素的现象，导致包括无乳链球菌在内的不少病原菌产生耐药性（柒壮林，2012；彭民毅，2014），同时严重影响罗非鱼的质量安全。因此，检测分析罗非鱼源无乳链球菌的耐药性及其耐药基因，对指导罗非鱼无乳链球菌病的临床用药和研究该菌的耐药机制具有重要意义。【前人研究进展】目前，四环素类抗生素仍是我国渔药中主要的抗链球菌药，而有关链球菌（Streptococcus spp.）对四环素类抗生素的耐药性和耐药基因研究主要集中在人源、牛源和猪源链球菌上。丁云芳等（2003）对从儿童痰标本分离获得的肺炎链球菌（S. pneumoniae）进行耐药性及tetM基因检测；白雪梅等（2010）研究了我国猪链球菌（S. pneumoniae）四环素耐药性与接合转座子的关系；丁月霞（2015）对从内蒙古奶牛乳房炎分离获得的无乳链球菌进行耐药基因检测。关于鱼源链球菌四环素类耐药基因研究，Meng等（2009）、Park等（2009）对患病牙鲆副乳房链球菌（S. parauberis）进行了药敏和四环素类耐药相关基因检测；Abdelsalam等（2010）、Tsai等（2015）检测了鱼源停乳链球菌（S. dysgalactiae）的耐药性和tetM基因；Dangwetngam等（2016）研究了泰国罗非鱼源无乳链球菌的耐药性及其tetM基因的携带情况。上述研究表明，不同来源链球菌的药物敏感性和耐抗生素种类不同，四环素类耐药基因携带情况也存在地域差异。【本研究切入点】近年来，在广西罗非鱼链球菌药敏调查和实际治疗中发现部分无乳链球菌分离株已对四环素类抗生素（多西环素）产生耐药性（胡大胜等，2012；彭民毅，2014），但在体外应用多西环素诱导无乳链球菌耐药揭示其耐药机制的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】对37株广西罗非鱼源无乳链球菌的耐药性及其4种四环素类耐药基因（tetM、tetO、tetL和tetS）的携带情况进行检测分析，并在离体条件下测定无乳链球菌对多西环素耐药性的获得速率，为指导罗非鱼无乳链球菌病的临床用药和揭示其耐药机制提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试菌株为从广西南宁市、玉林市和柳州市养殖患病罗非鱼分离鉴定获得的37株无乳链球菌，其中，南宁市8株，玉林市15株，柳州市14株，菌株来源基本信息详见表1。脑心浸液肉汤培养基（BHI）和脑心浸液琼脂培养基（BHIA）购自英国OXOID公司；抗生素原料药由浙江国邦现代医药有限公司惠赠；PCR扩增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；PCR缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、MgCl2、ddH2O、pMD18-T载体、感受态细胞DH5α、IPTG、X-GAL等均购自宝生物工程（大连）有限公司；琼脂糖购自美国Invitrogen公司；LB培养基购自北京陆桥技术股份有限公司；细菌DNA提取试剂盒及凝胶回收试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司。

1. 2 最小抑菌浓度（MIC）测定