CCR5第一和第二胞外环特异性结合短肽对大鼠结肠炎的炎症细胞浸润及NFκB/TNFα信号通路的影响

【摘要】目的研究CC趋化因子受体5（CCR5）第一和第二胞外环特异性结合短肽对三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的SD大鼠结肠炎的炎症细胞浸润及NFκB/TNFα信号通路的影响。方法采用5%TNBS构建大鼠结肠炎模型，分别给予2种CCR5短肽干预，通过病理细胞学分析、蛋白免疫印迹法、PCR等方法分别评估其组织学、基因及蛋白质水平的变化。结果与模型组相比，2组给予CCR5拮抗短肽的大鼠均表现为结肠炎组织学损伤减轻（P均<005），镜下可见中性粒细胞、淋巴细胞及巨噬细胞浸润减少（P均<005）。同时，NFκB/TNFα信号通路相关的蛋白及mRNA表达水平也较之模型组明显下降（P均<005）。结论特异性结合CCR5第一和第二胞外环的短肽可明显抑制TNBS诱导的SD大鼠结肠炎症，其机制可能是通过抑制NFκB/TNFα信号通路的激活。

【关键词】CC趋化因子受体5；拮抗肽；炎症性肠病；核转录因子κB；肿瘤坏死因子α

Effects of antagonistic peptides specifically binding to the first and second extracellular loops of CCR5 on inflammatory cell infiltration and NFκB/TNFα signaling pathway in rats colitisSong Yangda， Liu Sixue， Song Yihang， Shen Ximing， Huang Huarong， Zhong Yingqiang Department of Gastroenterology， Sun Yatsen Memorial Hospital， Sun Yatsen University， Guangzhou 510120， China

Corresponding author， Zhong Yingqiang， Email： zhongyingqiang@126com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of the specific binding of antagonistic peptides to the first and second extracellular loops of CC chemokine receptor 5（CCR5） upon the inflammatory cell infiltration and NFκB/TNFα signaling pathway in SD rats with colitis induced by trinitrobenzene sulfonic acid （TNBS） MethodsThe experimental SD rat models with colitis were induced by 5% TNBS， and intervened by two antagonistic peptides of CCR5 Pathological cytological analysis， western blot and PCR were performed to examine the histological changes of colon， proteins and mRNA levels of the NFκB/TNFα signaling pathway Results Compared with model group， the histological injuries of colitis were alleviated after administration of two antagonistic peptides of CCR5 （both P<005） The infiltration of neutrophils， lymphocytes and macrophages in rats treated with GH and HY peptides was significantly reduced （all P<005） Besides， the expression levels of the proteins and mRNAs related to the NFκB/TNFα signaling pathway were also significantly dowegulated （all P<005） ConclusionsAntagonistic peptides specifically binding to the ECL1 and ECL2 of CCR5 can evidently inhibit the inflammation in SD rats with TNBSinduced colitis， probably by suppressing the activation of the NFκB/TNFα signaling pathway

【Key words】CC chemokine receptor 5； Antagonistic peptide； Inflammatory bowel disease；

Nuclear factorκB； Tumor necrosis factorα

炎癥性肠病（IBD）是一组慢性肠道非特异性免疫炎症性疾病，其病理生理的本质是在肠道中有大量的各种炎症细胞浸润以及由其引发的各种炎症因子的释放，造成肠道黏膜的损伤与上皮细胞修复并存。CC趋化因子受体5（CCR5）是趋化因子受体的一种，其可调节各种细胞因子的产生，促使多种炎症细胞的趋化与激活，在IBD、哮喘、类风湿性关节炎等多种自身免疫性疾病的发病过程中发挥重要的作用[15]。核转录因子κB（NFκB）作为炎症与免疫反应的重要调控因子，同样参与了IBD的病理生理发展过程[6]。在我们前期的研究中发现，CCR5与IBD密切相关，在活动期IBD肠黏膜中高表达，并采用噬菌体肽库展示技术，已成功筛选出2条分别与CCR5第一、第二胞外环特异性结合的生物活性模拟肽[78]。本研究在此基础上进一步研究这两条短肽对三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的大鼠结肠炎的炎症细胞浸润及NFκB/TNFα信号通路的影响。

材料与方法

一、实验动物

健康成年雌性SpragueDawley（SD）大鼠40只，重量（200±20）g，购自中山大学实验动物中心，动物实验伦理批准编号为IACUCDB160313，饲养条件为SPF级。

二、主要试剂与仪器

5%TNBS购自Sigma公司；Trizol RNA提取试剂盒、Premix Taq PCR试剂盒及Realtime PCR试剂盒购自Takara公司；NFκB通路抗体试剂盒[包括兔抗鼠IKKβ， PhosphoIKK α/β（Ser176/180）， p65， Phosphop65（Ser536）， IκBα以及PhosphoIκBα（Ser32）抗体]购自Cell Signaling Technology公司；兔抗鼠TNFα，βactin抗体购自Novus公司；CCR5第一、第二胞外环的两条活性模拟短肽由上海吉尔生化有限公司合成，纯度为95%，其序列分别为GHWKVWL（简称GH），HYIDFRW（简称HY）。实时荧光定量PCR仪（Light Cycler96）。

三、方法

1实验分组

SD大鼠在经过1周的适应性饲养后，随机分为以下4组：正常对照组（Normal组）、模型组（Model组）、GH短肽治疗组（GH组）、HY短肽治疗组（HY组）。

2IBD动物模型的建立

在经典的TNBS造模方法的基础上稍加改动[9]。具体方法大致为：造模前大鼠禁食不禁水24 h，10%水合氯醛麻醉，经石蜡油润滑后，将16号大鼠灌胃针由肛门轻轻插入肠腔约8 cm，缓慢灌入预先配好的灌肠液（按大鼠100 mg/kg的TNBS与等体积乙醇混合而成），灌入完毕后保持大鼠倒置5 min，然后将大鼠以头低尾高约呈30°的体位放回于笼中垫料上，自然苏醒，恢复自由饮食。本实验方案经中山大学实验动物管理与使用委员会以及实验动物伦理委员会的批准。

3给药与取材

在经TNBS造模后的第3日，2个治疗组分别经大鼠尾静脉给予GH短肽（35 mg/kg）和HY短肽（25 mg/kg），而正常对照组和模型组的大鼠则用尾静脉注射09%生理盐水代替。给药时间为每日1次，连续7 d给药。给药浓度的选择则是根据我们先前的实验结果[10]。在TNBS造模后的第14日，通过10%水合氯醛以腹腔注射过量麻醉药处死大鼠，取大鼠全结肠，沿肠系膜剪开后，用预冷生理盐水清洗。之后在模型及治疗组的病变边缘处和正常对照组的对应肠段取材，所取组织一部分用于病理学检测；另一部分于-80°冰箱保存，用于后续的分子生物学检测。

4组织学评价

新鲜组织4%多聚甲醛固定过夜，石蜡包埋，切片（厚度为5 μm），苏木素伊红染色后，在显微镜下观察。镜下的评价内容包括溃疡、炎症程度和范围以及炎症细胞的计数。纳入计数的炎症细胞包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞以及巨噬细胞，计数方法为在×400高倍镜下随机选取10个独立视野，统计上述各炎症细胞的数目。

5蛋白提取与蛋白免疫印迹法

总蛋白通过RIPA裂解液提取。通过BCA法测定蛋白浓度后，将等量的蛋白样本与相应体积的loading buffer相混合成20 μl体系，加入SDSPAGE凝胶中电泳（初为恒压60 V，后为恒压110 V），再转膜至PVDF膜上（恒流250 mA，100 min，PVDF膜孔径为045 μm）。接着放入5%脱脂牛奶中室温封闭1 h，后加入相应的一抗（抗体稀释比例均为1∶1 000），4℃过夜。第2日经过TBST洗膜后，加入二抗（抗体稀释比例为1∶5 000）室温孵育1 h。最后通过ECL化学发光法显影，并拍照保存结果。条带结果分析通过ImageJ软件进行灰度值分析比较。以βactin作为总蛋白的内参。

6实时逆转录PCR

通过Trizol法提取结肠组织总RNA，然后通过逆转录试剂盒，合成cDNA。接着加入目标基因相对应的引物（引物序列见表1），对各目标基因进行PCR扩增，通过检测相结合SYBR染料的信号，得到对应的循环数Ct值。PCR的反应体系为：1 μl cDNA、5 μl 2×Sybr Green Premix Ex Taq试剂、04 μl正向引物和04 μl反向引物，无菌双蒸水補足至10 μl。PCR扩增参数为：95℃30 s，95℃5 s，60℃ 20 s，40个循环。内参基因为βactin。最后结果的分析计算采用2ΔΔCt法计算各基因表达的相对变化[11]。

表1RTPCR的引物序列大鼠基因引物（53）βactinF： GGGAAATCGTGCGTGACATTR： GCGGCAGTGGCCATCTCp105F： GATGGGACGACACCTCTACACATAR： CCCAAGAGTCGTCCAGGTCAp100F： CTGATGGCACAGGACGAGAAR： TGGGCTATCTGCTCAATGACACp65F： CGACGTATTGCTGTGCCTTCR： TTGAGATCTGCCCAGGTGGTAI kappa B激酶F： TACGGTCCCAATGGCTGTTT（IKK）R： GGTATGTGTGAATGGTGCCTGTTNFαF： TGGCGTGTTCATCCGTTCTCTACR： CTACTTCAGCGTCTCGTGTGTTTC四、统计学处理

统计学分析采用SPSS 220。计量数据以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSDt检验。P<005为差异有统计学意义。

结果

一、CCR5短肽对大鼠结肠炎的组织学和炎症细胞浸润的影响

在显微镜下，与正常对照组相比，模型组可观察到溃疡形成，上皮缺损，隐窝损伤，以及累及结肠黏膜全层的严重的炎症反应，并伴随着大量的中性粒细胞和淋巴细胞浸润，以及一定数量的巨噬细胞和嗜酸性粒细胞浸润（图1A、B）。在GH短肽治疗组和HY短肽治疗组中，炎症则主要局限于黏膜和黏膜下层（图1C、D），并且与模型组相比，2个短肽治疗组均表现为不同程度的中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞浸润程度减少（P均<005），但嗜酸性粒细胞则无明显变化。另外，GH短肽治疗组和HY短肽治疗组各炎症细胞的数量比较差异并没有统计学意义。各炎症细胞计数的结果见表2。

二、CCR5两短肽对NFκB/TNFα信号通路相关蛋白的影响

4组间pIKKα、pp65、IκBα、pIκBα、TNFα比较，差异有统计学意义（F值分别为1108、22340、969、3178、25210，P均<001）。其中，与正常对照组相比，模型组大鼠pIKK，pp65，pIκBα和TNFα蛋白水平分别约为正常对照组的13倍、20倍、17倍和17倍，而IκBα蛋白水平则下降（P均<005），提示模型组IκBα的降解和NFκB通路的显著激活。与此相反，与模型组相比，GH或HY短肽治疗均可不同程度地引起pIKK、pp65、pIκBα和TNFα蛋白水平的下降。而短肽治疗组和正常对照组的IκBα水平差异则没有统计学意义，提示短肽治疗组可抑制IκBα的降解。另外，4个组的IKK和p65的蛋白水平差异均没有统计学意义（F值分别为258和301，P均>005，见图2）。

三、CCR5短肽对NFκB/TNFα信号通路相关基因的影响

通过Real timePCR测定了包括了p105、p100、p65、IKK和TNFα在内的NFκB/TNFα通路相关基因的相对表达水平（图3）。4组间p105、p100、IKK和TNFα比较，差异有统计学意义（F值分别为34380、2992、30151和1998，P均<001）。其中，从图中可知，模型组大鼠p105、p100、IKK以及TNFα的mRNA水平较之正常对照组升高（P均<001），分别约为正常对照组的160倍、38倍、80倍和68倍。与此相反，GH组和HY组的大鼠p105、p100、IKK以及TNFα的mRNA水平较之模型组则出现了下降（P均<001）。另外，4组之间p65的mRNA表达水平差异没有统计学意义（F=313，P>005）。

讨论

CCR5是一种G蛋白偶联受体，在结构上包含一个N末端，3个胞外环（分别为ECL1，ECL2和ECL3），七次跨膜的α螺旋结构域，3个胞内环，以及胞内的C端，其中胞内区的羧基末端含丝氨酸/苏氨酸，可发生磷酸化，从而与G蛋白相偶联，参与MAPK、JAKSTAT、NFκB等信号转导通路的调控[12]。

在哺乳动物中，NFκB家族主要由5种蛋白组成，包括RelA（即p65）、cRel、RelB、NFκB1（p105/p50）和NFκB2 （p100/p52）。其中p105和p100分别为p50和p52的前体。这5种蛋白可任意两两组合成同源二聚体或异源二聚体，但以p50p65异二聚体最为常见[13]。在静息状态下，NFκB与抑制性蛋白IκB紧密结合，以无活性状态存在于细胞质当中。在炎性信号的刺激下（如TNFα， LPS， IL1等），IKK可被激活。接着IKK催化IκB发生磷酸化，进而IκB可被泛素标记，从而被转运到蛋白酶体发生降解，释放出游离的NFκB。之后，游离的NFκB便可通过核孔复合物在核转位序列的介导下转位入核，对多种炎症与免疫相关基因（包括IL1β和TNFα等）的转录发挥调控作用[14]。

迄今为止，已有许多研究探索了CCR5与IBD之间的关系。有研究发现，TAK779（一种非肽类小分子CCR5拮抗剂）可缓解葡聚糖硫酸钠诱导的动物結肠炎，抑制单核/巨噬细胞的浸润和促炎因子如IL1β和IL6的产生[15]。在人类IBD的研究中也发现了相似的结果：CCR5在人类IBD患者的肠黏膜中高度表达，且表达量与疾病的活动度相关[7]。这些实验的研究结果均提示了CCR5在IBD发病过程中所扮演的重要角色，同时也提示了抑制CCR5可成为IBD治疗的新思路。

时至今日，已有多种CCR5抑制剂被开发，主要包括趋化因子修饰衍生物，非肽类小分子化合物，单克隆抗体和短肽类化合物[15]。其中本研究所采用的短肽类拮抗剂，它可与CCR5受体的胞外结构高度特异性结合，亲和力及安全性均较高，生产成本较低等优势。因此，我们通过噬菌体肽库展示技术筛选并合成了两条特异性结合CCR5胞外环的短肽，并探究了它们在大鼠结肠炎中的治疗效果[8]。

本研究发现，与模型组相比，2个短肽治疗组均出现不同程度炎症明显范围缩小，中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞浸润程度的明显下降。既往研究已发现CCR5广泛表达于树突状细胞、单核/巨噬细胞、中性粒细胞以及效应和调节性T细胞等细胞膜的表面。结合这些研究结果，本研究表明CCR5与结肠炎的中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞迁移浸润作用密切相关，而特异性结合CCR5胞外第一、第二环的两条短肽可在一定程度上抑制上述炎症细胞的浸润作用，减轻组织学损伤。

接下来，蛋白免疫印迹法和PCR的结果进一步证实了GH和HY短肽对NFκB/TNFα通路的抑制作用，主要表现为抑制IKK、p65以及IκBα的磷酸化，减少p100、p105、IKK和TNFα的表达，但是p65的总蛋白水平在各组之间并无差异。此前提到，p50p65异二聚体在与IκB解离后，可通过核孔复合物在NTS的介导下转位入核，故NFκB通路激活时，p65的总蛋白水平可保持不变，而表现为核内的p65水平升高，因而也解释了本实验中p65的总蛋白水平在各组之间无差异的结果。另外p65基因的表达在4组之间也没有明显差异，也提示了p65基因表达的稳定性以及可能存在着其他对NFκB通路调节的机制。

值得注意的是，不管是在组织学、蛋白抑或是基因水平，2条短肽GH和HY组之间都没有发现统计学差异。关于CCR5受体的功能性结合位点，不同的研究有不同的观点。早期关于CCR5与HIV1如何入侵CD4+T细胞的研究发现CCR5受体的N端和第二个胞外环（即ECL2）在HIV1共受体功能中发挥重要作用。而在2013年，Schnur等通过MRI技术绘制并研究了CCR5各胞外结构与其天然配体RANTES相结合的位点和亲和力。就单一结构而言，N端和ECL2与RANTES的亲和力更高。但是ECL1ECL2共同体与RANTES的亲和力明显强于ECL2单体。这是由于只有ECL1存在时，ECL2才能保持更稳定的构象。也就是说，不管是阻断ECL1还是ECL2中的任意一个，都可以导致CCR5与配体的结合力下降。另外，这一发现也提示了同时阻断ECL1和ECL2可能可以更好地抑制CCR5的功能。

因此，本研究的结果表明CCR5第一、第二胞外环特异性结合的拮抗短肽可通过抑制NFκB/TNFα信号通路，抑制TNBS诱导的大鼠结肠炎的炎症细胞的浸润，减轻组织学损伤，所以，CCR5拮抗短肽也许可以成为IBD治疗的新方法。通过进一步的研究和探索2条短肽的药物代谢动力学特点以及两者是否具有协同作用，将有助于未来CCR5拮抗短肽的临床应用。

参考文献

[1]Jones KL， Maguire JJ， Davenport AP Chemokine receptor CCR5： from AIDS to atherosclerosisBr J Pharmacol，2011，162（7）：14531469

[2]Moldoveanu AC， Diculescu M， Braticevici CF Cytokines in inflammatory bowel diseaseRom J Intern Med，2015，53（2）：118127

[3]Hogaboam CM， Carpenter KJ， Schuh JM， Proudfoot AA， Bridger G， Buckland KF The therapeutic potential in targeting CCR5 and CXCR4 receptors in infectious and allergic pulmonary disease Pharmacol Ther，2005，107（3）：314328

[4]梁蓉蓉，黄花荣CCR5与支气管哮喘免疫学发病机制研究进展新医学，2016，47（1）：1216

[5]Vierboom MP， Zavodny PJ， Chou CC， Tagat JR， PuglieseSivo C， Strizki J， Steensma RW， McCombie SW， CelebiPaul L， Remarque E， Jonker M， Narula SK， Hart BInhibition of the development of collageninduced arthritis in rhesus monkeys by a small molecular weight antagonist of CCR5Arthritis Rheum，2005，52（2）：627636

[6]Sun SC， Chang JH， Jin JRegulation of nuclear factorκB in autoimmunityTrends Immunol，2013，34（6）：282289

[7]Ye X， Liu S， Hu M， Song Y， Huang H， Zhong YCCR5 expression in inflammatory bowel disease and its correlation with inflammatory cells and βarrestin2 expression Scand J Gastroenterol，2017，52（5）：551557

[8]刘思雪，胡梅，叶小研，黄花荣，钟英强应用噬菌体展示肽库技术淘选大鼠CCR5膜外第一、二胞外环特异性结合的活性拮抗肽与初步鉴定中国病理生理杂志，2015，31（07）：12251230

[9]Morris GP， Beck PL， Herridge MS， Depew WT， Szewczuk MR， Wallace JLHapteninduced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colonGastroenterology，1989，96（3）：795803

[10]胡梅，宋楊达，刘思雪，宋铱航，沈溪明，黄花荣，钟英强CCR5第一、二胞外环特异性结合的拮抗短肽对TNBS诱导SD大鼠结肠炎的治疗作用中国病理生理杂志，2017，33（5）：902907

[11]Livak KJ， Schmittgen TDAnalysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2（Delta Delta C（T）） MethodMethods，2001，25（4）：402408

[12]Lee NJ， Choi DY， Song JK， Jung YY， Kim DH， Kim TM， Kim DJ， Kwon SM， Kim KB， Choi KE， Moon DC， Kim Y， Han SB， Hong JTDeficiency of CC chemokine receptor 5 suppresses tumor development via inactivation of NFκB and inhibition of monocyte chemoattractant protein1 in urethaneinduced lung tumor modelCarcinogenesis，2012，33（12）：25202528

[13]Ghosh S， Hayden MSNew regulators of NFkappaB in inflammationNat Rev Immunol，2008，8（11）：837848

[14] Panday A， Inda ME， Bagam P， Sahoo MK， Osorio D， Batra S Transcription factor NFκB： an update on intervention strategies Arch Immunol Ther Exp （Warsz），2016，64（6）：463483

[15]Tokuyama H， Ueha S， Kurachi M， Matsushima K， Moriyasu F， Blumberg RS， Kakimi KThe simultaneous blockade of chemokine receptors CCR2， CCR5 and CXCR3 by a nonpeptide chemokine receptor antagonist protects mice from dextran sodium sulfatemediated colitisInt Immunol，2005，17（8）：10231034

（收稿日期：20180108）

（本文编辑：杨江瑜）