小麦诱导抗性基因TaWIR1b的克隆及表达分析
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1.1供试材料
试验所用河南省区试小麦品种‘新农19’（Xinnong19）、‘新麦19’（Xinmai19）及小麦全蚀病菌菌株GaNS90均由河南省农业科学研究院植物保护研究所小麦病害课题组收集、保存。
1.2试验方法
1.2.1试验材料的准备与取样
挑取均匀饱满的小麦种子，用75%乙醇表面消毒30 s，清水洗净后转移至培养皿中浸种24 h，然后种植于营养钵中温室（20℃）培养，每天光照16 h。至长出4叶后将整株苗连根拔出冲洗干净，置于放有湿润卫生纸的托盘内，用打孔器打取全蚀菌菌饼并放置于根部，保鲜膜封住托盘。将托盘置于培养箱中，采集接菌后0、2、3和8 d以及同期不接菌对照的小麦根，用锡箔纸包好液氮速冻，存放于-80℃冰箱备用。
1.2.2总RNA提取及第一链cDNA合成
采用 TRIzol法（参考TaKaRa说明书）提取小麦根的RNA，加入DNase纯化RNA。用Eppendorf Biospectrometer分光光度计检测样品的浓度和纯度。用TaKaRa的反转录试剂盒获得cDNA第一链。-20℃保存备用。
1.2.3目的基因获得及序列分析
根据目的基因TaWIR1b（Accession no. M94959.1）的ORF框两端序列设计引物对：WIR1F：CTCGAAACACACCAGCAT；WIR1R：GGTGCGTGACAGTAGATTAAC。以‘新农19’的cDNA为模板进行扩增，扩增体系如下：10×Taq buffer 2 μL，dNTPs（10 mmol/L）0.4 μL，上游引物（10 μmol/L）0.2 μL，下游引物（10 μmol/L）0.2 μL，cDNA 1 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，ddH2O补足至20 μL。反应程序为：94℃ 3 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环；72℃ 10 min。产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，UVP凝胶成像系统照相。电泳后回收目标片段，连接入pMD19T simple载体，转化TJ1感受态细胞，提取质粒，送上海生物工程有限公司进行测序。
利用NCBI（http：∥ncbi.nlm.nih.gov/）中的ORF Finder（http：∥www.ncbi.nlm.nih. gov/gorf/gorf.html）工具查找目的片段的开放阅读框。通过BLAST对克隆的目的片段进行同源性分析。
1.2.4内参及目的基因定量引物设计及检测
以组成型表达基因，小麦的26S rRNA（Accession no.Z11889.1）作为内参对照，引物序列[4]：26SF： GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC；26SR：TCTCCCTTTAACACCAACGG。根据克隆得到的基因序列，利用Primer 5.0 软件设计定量PCR引物，序列如下：WIR1MF：TGCCGCACAGTTTATGGATG；WIR1MR：TAAGGTGGTGCGTGACAGTAGA。
先通过普通 PCR 扩增判断引物的特异性，产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。选择最佳退火温度，确保没有引物二聚体产生后按该退火温度进行实时荧光定量PCR。通过梯度稀释模板的方法绘制标准曲线，检测引物的扩增效率，根据熔解曲线判断引物的特异性。
1.2.5荧光定量PCR检测与分析
应用 ABI PRISM 7500实时定量PCR仪，以各个取样点的cDNA 为模板，进行PCR 扩增。反应体系为：2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL，50×ROX Ⅱ0.4 μL，WIRIMF（10 μmol/L）0.8 μL，WIRIMR（10 μmol/L）0.8 μL，cDNA第一链2 μL（10×稀释的 RNA 反转录产物），ddH2O 补足至20 μL。反应程序为：95℃ 1 min；95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 40 s，40个循环。于 72℃收集荧光信号，反应结束后进行荧光值变化曲线和熔解曲线分析。每个反应重复3次，Ct值取平均值。以各取样时间点小麦 26S rRNA 的量为内参对照来确定目标基因的相对量，利用2-△△Ct方法[5]来确定目的基因的相对表达量。
2结果与分析
2.1目的基因获得
提取所有试验材料的总RNA。用Eppendorf Biospectrometer检测，所提取的总RNA OD260/OD280值为2.0左右，表明RNA质量较好，OD260/OD230值大于2.0，表明RNA纯度较高，无小分子盐类污染。用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测提取的总 RNA，没有降解现象，可用于下一步试验。根据试剂盒说明，利用TaKaRa First Strand cDNA synthesis进行cDNA第一链合成。
利用扩增基因全长的引物扩增‘新农19’的cDNA，获得了370 bp左右的特异片段，将该片段回收、克隆转化后送公司测序。测序结果表明片段长度为373 bp，其序列与已报道的TaWIR1b基因序列完全相同。利用 NCBI 中 ORF finder工具在克隆片段中找到长258 bp完整开放阅读框，该ORF编码86个氨基酸残基（图1）。与已知基因TaWIR1b编码的氨基酸序列100%一致。获得的ORF框N末端具有丰富的甘氨酸（glycine G）和脯氨酸（proline P）重复，是TaWIR1b的功能区域。
2.2定量表达分析
以小麦核糖体26S rRNA基因作为内参对照，采用相对定量的方法分析全蚀菌侵染胁迫条件下基因TaWIR1b在不同互作条件下的表达模式。结果表明：小麦品种‘新农19’中基因TaWIR1b受到病原菌侵染后诱导上调表达，且在接种后第3天达到高峰值，比对照高出143.97倍；而感病品种‘新麦19’中基因的表达高峰出现在接菌后第8天，且仅为对照的4.22倍，各时期基因的表达量均显著低于‘新农19’（图2）。
3讨论
小麦WIR基因早在1989年被克隆，目前有TaWIR1a、TaWIR1b和TaWIR1c 3个基因被克隆。已有结果表明，该类基因受到多种病原物的诱导上调表达。其中TaWIR1a同源基因在大麦与大麦叶锈菌和小麦叶锈菌互作及大麦对大麦白粉菌的基础防御和小种专化型抗性中均可以被诱导表达[67]；WIR1在小麦中参与对小麦叶锈菌的非小种专化型抗性和基础防御过程[8]。Coram等的研究结果表明TaWIR1a基因参与小麦对条锈菌的小种专化型抗性过程[9]。Diethelm等比较了小麦抗、感品种中TaWIR1b基因的表达情况，认为该基因在小麦对赤霉病的抗性中发挥作用，将该基因定位在小麦5DS染色体上，并将其列为抗病基因的候选基因[10]。
本研究结果表明，该类基因受到全蚀病菌的诱导而上调表达，在抗病品种‘新农19’中的表达量显著高于感病品种‘新麦19’，峰值出现得也较早，提示该基因可能参与‘新农19’对全蚀病菌的抗病过程。目前对于TaWIR1的功能没有定论。利用大麦条纹花叶病毒（BSMV）介导的基因沉默（virus inducing gene silencing， VIGS）系统分析TaWIR1基因的功能时发现，虽然在病菌诱导后该基因出现上调表达，但并未发现对小麦白粉菌的定殖有影响[12]。同时在小麦中过表达TaWIR1a对于白粉菌吸器的形成不产生影响[11]。沉默试验小麦材料‘Renan’中全部TaWIR1基因对于小麦白粉菌的发育没有显著影响[12]。Diethelm等则认为该基因对活体营养型病原物和死体营养型病原物的作用是截然相反的，其在植物与死体营养型的病原菌互作时参与抗病过程[10]。小麦全蚀菌属于死体营养型病原物，其启动的小麦抗性和防御反应很可能与同是死体营养型的小麦赤霉菌模式相同，下一步需要深入开展TaWIR1b基因在‘新农19’与全蚀菌互作中的功能研究，为阐明基因的作用机理及进一步利用奠定基础。
参考文献
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（責任编辑：杨明丽）
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