植物防御素在抗植物病害方面的应用

摘要 植物防御素是一类碱性、富含半胱氨酸、具有抗菌活性的低分子量多肽。不同植物防御素抗菌活性差异较大，但高级结构相似，都是1个α-螺旋和3个反向平行的β片层结构。植物防御素具有抑制酶活、抑菌、抑制癌细胞生长等功能，其作用机理主要是与真菌细胞膜上鞘脂等复杂脂类相互作用。植物防御素具有抗菌谱广泛和高效性的特点，将在植物抗病基因工程和作物品种改良中发挥重要作用，并有望开发成为新型的抗菌剂以减少农药的使用。本文综述了植物防御素的结构、功能、作用机理以及在植物抗病虫害基因工程上的应用研究进展。

关键词 植物防御素；抑菌作用；基因工程；病害

中图分类号 Q946 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）07-0147-03

Application of Plant Defensin on Plant Disease Resistance

HE Ling 1 YANG Su-yun 1 LIU Yuan 1 CAO Xu 1 ZHONG Jing 1 ZHU Xi-wu 1，2 WU Juan 1，2 *

（1 College of Agriculture and Biotechnology，Hunan University of Humanities，Science and Technology，Loudi Hunan 417000；

2 Collaborative Innovation Center for Farmland Weeds Control ）

Abstract Plant defensin is one kind of short peptides with low molecular weight，basic，cysteine-rich and antimicrobial activity.Antimicrobial activity of different plant defensin have large difference，but the higher structures are similar，which have one α-helix and three antiparallel β-sheets.Plant defensins can inhibit enzyme activity，antifungal activity and cancer cell proliferation.The mechanism of plant defensins is that it binds the complex lipids those from the outside of fungal plasma membrane.Because of broad anti-microbes activity and high efficiency，it will play an important role in plant genetic engineering of disease resistance and varieties improvement of plant，even be used as novel germicides in order to reduce the use of pesticides.The structural characteristics，biological functions，mechanism，progress in plant genetic engineering of plant defensins were reviewed in this paper.

Key words plant defensin；antifungal activity；genetic engineering；disease

植物像動物一样也有一个内在的防御系统，在外部病原菌侵染下，植物体内精巧的免疫防御系统会被诱导激活。这种反应一般称为植物的系统诱导抗性，对一系列不相关的病原菌有广谱抗性[1]。植物体内会合成大量的抗性化合物，一些抗菌蛋白质也会被诱导产生，以阻止病原菌进一步繁殖扩展[2]。植物防御素正是这样一类具有抗菌活性的低分子量短肽。

防御素最早发现于哺乳动物多形核中性粒细胞中，后来从昆虫中也提取到了昆虫防御素，在分子量、电荷及对革兰氏阳性菌的抗性上，与哺乳动物防御素有很大的相似性[3]。1990 年，Mendez 等发现了第1个植物防御素，其氨基酸序列、保守氨基酸位点和三维结构与昆虫防御素相似[4]。植物防御素是一类分子量小（约5 kD，由45～54 个氨基酸组成）、碱性、富含半胱胺酸、具有抗菌活性和复杂三维结构的阳离子多肽。

1 植物防御素的结构

防御素一般是分泌型蛋白，其编码区域主要可分为2个部分。一个是信号肽区域，主要由疏水性氨基酸组成，引导防御素前体蛋白与膜脂结合通过膜分泌到胞外空间；另一个是成熟肽区域，前体蛋白到达特定部位后，切除信号肽成为成熟蛋白质发挥作用[5]。目前，已鉴定出数百种植物防御素，不同植物防御素抗菌活性具有较大差异。植物防御素通常由50个左右氨基酸残基组成，分子量约为5.0 kD，其中除8个保守半胱氨酸残基外，其余均非常不保守。同源性较低，但高级结构非常相似。如从萝卜种子中分离的防御素（Rs-AFP1），其高级结构通过核磁共振阐明由1个α-螺旋和3个反向平行的β-折叠片层组成一个紧密的球形结构，位于α-螺旋中的第21位、25位Cys与位于第3个β-折叠片层中的第45位、47位Cys形成了2对二硫键，8个保守半胱氨酸残基形成了4对二硫键对维持该结构发挥关键作用，因此命名为Cys稳定的α-螺旋、β-折叠结构，简称CSαβ（Cysteine stab-ilized α β motif）[6]。豌豆种子防御素PsD1[7]和绿豆防御素VrD1[8]的基本结构也类似。

2 植物防御素的功能

2.1 抑制酶的活性

植物防御素SIα1、SIα2和SIα3均对昆虫消化酶α-淀粉酶有特异性抑制作用，但是对来自其他生物的α-淀粉酶无抑制活性或只有很弱的抑制活性[6]。另外，来自绿豆的防御素VrD1在昆虫饲料中含量达0.2%时就能使昆虫致死[9]。因此，植物防御素很有可能通过抑制昆虫对淀粉的消化来杀虫，在植物抗虫方面发挥重要作用。来自杀虫植物猪肠豆（Cas-sia fistula Linn.）的一种植物防御素5459有胰蛋白酶抑制活性，而另外一种多肽5144则无该活性，二者只有几个氨基酸的区别[10]。

2.2 抑菌作用

大部分植物防御素都具有抑制真菌生长的功能，其IC50取决于真菌种类和植物防御素来源。H.Saitoh等[11]用马铃薯病毒载体PVX在本生烟中表达芥末的防御素蛋白WT1，再从病毒感染的叶片中提取，并用亲和层析的方法纯化蛋白，测得WT1抑制稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）的IC50为5 μg/mL，抑制灰霉病菌（Botrytis cinerea）的IC50为20 μg/mL。李 平等[12]研究报道苜蓿种子防御素基因alfAFP在酵母中有效分泌表达，加alfAFP酵母表达产物22.0 μg 时对纹枯病有较强的抑菌圈，加入量为21.98和22.00 μg 时对稻瘟病和白叶枯病有一定的抑制作用。

植物防御素的抗微生物活性主要表现在抗真菌上，也能抑制部分细菌，但作用偏弱。如H.Saitoh等[11]报道纯化的防御素WT1-His6在浓度为10 μg/mL时对病原真菌稻瘟病菌和灰霉病菌的菌丝生长有明显的抑制作用，但是对病原细菌假单胞菌没有明显抑制作用；浓度达到20 μg/mL时，才能观察到微弱的生长抑制作用。

2.3 抑制癌细胞生长

植物防御素对特定种类人肿瘤细胞的抑制活性已有报道，如来自田豆的植物防御素Sesquin能够抑制白血病的L1210和M1细胞系，抑制率分别达到35%、80%；对乳腺癌MCF-7细胞系抑制率约80%[13]。

3 作用机理

与人、昆虫的防御素不同，植物防御素在人工磷脂膜上不能形成离子通道，也不改变磷脂双分子层的电荷特性。说明其不直接作用于真菌质膜磷脂[14]。因为真菌细胞膜上磷脂分布于内侧，鞘脂、麦角甾醇等复杂脂类分布在外侧，所以植物防御素更可能是作用于膜上鞘脂等复杂脂类，然后诱导一系列快速反应，如Ca2+ 吸收、K+ 流出、改变膜结构及通透性等[15]。大丽菊植物防御素（DmAMP1）与真菌质膜中甘露糖苷二肌醇磷脂酰神经酰胺M（IP）2C相互作用，来自胡萝卜种子的植物防御素（RsAFP2）则是结合菌类质膜中葡糖神经酰胺（GlcCer）[16]。ELISA检测发现，RsAFP2只作用于真菌类的神经酰胺，并不作用于人和植物，因为其神经酰胺结构不同，如神经鞘胺脂底部分枝的9-甲基基团、不饱和程度和脂肪酸链长度。这些结构特征决定着其与防御素的作用特点[16]。

4 在植物抗病虫害基因工程中的应用

植物防御素所表现出来的生物学活性如抗微生物、杀虫活性等，使其成为植物抗病虫害基因工程的优良候选材料。禾谷类是病虫害高发作物，防御素基因工程在禾谷类作物的病虫害抗性研究中起到了重要作用。Kanzaki等[17]用农杆菌介导法将防御素WT1的基因导入水稻，22个T2代纯合株系对稻瘟病菌表现出不同程度的抗性，由其中2个高抗株系得到的T3代植株病斑比对照株缩小了约1/2。

有些植物防御素不僅对1种真菌起作用，而是对多种植物真菌病原体均有抑制活性，是其在植物抗病虫害中的又一大优势。真菌病害是瓜类危害最严重的病害，在西非广泛种植的一种高度耐干旱甜瓜Egusi的产量受枯萎病和黑斑病的影响极大。2010年Ntui等[18]通过根瘤农杆菌EHA101介导，获得转防御素WT1基因甜瓜。对转基因植株进行了RT-PCR、northern和western blot分析，目的基因在甜瓜植株中有效表达。离体叶片接种枯萎病菌或早疫病菌后，引起的病征比非转基因对照延迟3 d出现，且坏死病斑较小，总面积仅有非转基因对照的1/3。整株植株的体外感染试验结果类似，对于早疫病菌引起的黑斑病和枯萎病菌引起的枯萎病，转基因植株较非转基因植株表现出更高的抗性。值得注意的是，这些转基因株系表现出对枯萎病和黑斑病的抗性是非特异性的，意味着这种抗性能够长久的保持，而且在田间环境下也是有效的。这些转基因甜瓜可能对于其他真菌病害也有抗性，如Kanzaki等[17]报道表达防御素WT1的转基因水稻能抑制稻瘟病生长，Khan等[19]报道表达防御素WT1的转基因土豆对灰霉病菌表现很高的抗性。因此，推测防御素WT1能抗许多真菌病原菌，甚至包括一些细菌病原菌。

抗病基因抗菌谱不够广、病菌对其敏感度易下降或田间抗病效果不理想等缺点限制了植物抗病基因工程的发展。植物防御素是对大部分动植物真菌病害和细菌病害都有效的一类抗菌蛋白，其基因可作为优良抗病基因转入植物基因组，且其本身对于人和动物食用安全，如防御素WT1基因来自芥末（一种日本料理的主要调味料）。目前已有多种防御素基因导入植株中用于增加植株抗性，并检测到已表达的植物防御素蛋白及其抗菌活性。如把来自紫花苜蓿防御素的基因MsDef1转入番茄基因组中，获得转基因番茄植株对枯萎病有较好抗性[20]。Terras等[21]将一种萝卜种子防御素Rs2AFP2的基因转入烟草，其表达量可达叶片总蛋白的0.2%，明显增强了烟草植株对小叶病原菌烟草赤星病菌（Alternaria longipes）的抗性，之后有研究人员将其应用于番茄，获得类似结果[22]。

但转植物防御素基因的植物一般不会对某种病原菌产生完全抗性，要想获得完全的抗性或者更强的抗性，可以将其他抗性基因一起转入植物细胞[18，23]。植物防御素与其他抗菌化合物协同作用，有助于增强植株抗性，甚至还可能增强对非生物胁迫的适应能力[6]。Chen等[24]将烟草的β-1，3-葡聚糖酶、苜蓿防御素alfAFP及双价基因转入番茄，转基因植株对青枯病菌（Ralstonia solanacearum）的抗性增强，且双价基因转化株抗性更高。

5 结语

总之，植物防御素以其广泛的抗菌谱和高效性的特点，有望在研制新型绿色生态抗菌剂和培育新品种方面发挥重要作用，建立无污染的农业生态生产模式。但是植物防御素的胞内受体以及外界条件对植物防御素基因表达的诱导机理尚不明确，植物防御素基因转入植物后基因表达的沉默问题也需要进一步研究。

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