AT1受体拮抗剂和ACEI对大鼠心肌肥厚时AT1,mRNA表达的影响

[摘要] 目的 探讨血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）及其受体AT1在心肌肥厚中的作用，研究DMP811（AT1受体拮抗剂）、培哚普利（ACEI）对AngⅡ诱导的心肌肥厚大鼠心肌AT1 mRNA表达水平的影响。 方法 24只6周龄的SD雄性大鼠随机分为4组：正常对照组、AngⅡ组、AngⅡ+DMP811组、AngⅡ+培哚普利组，每组6只。分别皮下埋藏装有生理盐水或AngⅡ的渗透微泵。1周后观察心脏质量、心脏质量/体质量的变化，采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测心肌AT1mRNA表达情况，并进行比较。 结果 ①输注AngⅡ 7 d不会明显影响大鼠的体质量，但可使大鼠的心脏质量、心脏质量/体质量显著增加。AngⅡ组较正常对照组心脏质量、心脏质量/体质重明显增加（P<0.05）；与AngⅡ+DMP811组、AngⅡ+培哚普利组相比，AngⅡ组心脏质量、心脏质量/体质量也明显增加，差异具有统计学意义（P<0.05），而AngⅡ+DMP811组、AngⅡ+培哚普利组的心脏质量、心脏质量/体质量差异无统计学意义（P>0.05）。②AngⅡ组的AT1 mRNA水平较对照组上调（84.5±3.0）%（P<0.01），DMP811、培哚普利药物干预，可使AngⅡ诱导的AT1 mRNA的转录上调有效阻断。而AngⅡ+DMP811组、AngⅡ+培哚普利组的AT1 mRNA水平差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 心肌肥厚时AT1 mRNA的表达水平明显增加，且AngⅡ诱导了AT1 mRNA的转录上调。而AngⅡ导致的上述改变能被DMP811、培哚普利有效阻断，为以后防治心肌肥厚提供了重要依据。

[关键词] AT1受体拮抗剂；培哚普利；心肌肥厚

[中图分类号] R972 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）09（c）-0004-03

心肌肥厚指心脏大小、形状、质量及细胞水平的各种变化。长期的心肌肥厚很容易导致心力衰竭或猝死[1]。心肌肥厚时，尤其是室间隔的非对称性肥厚、心律失常、运动耐量受损及猝死，是一种原发于心肌的疾病[2]。分子遗传学研究表明，心肌肥厚是心肌标志蛋白表达水平升高，心肌细胞体积增大，同时伴随心脏质量增加的过程[3]。肾素-血管紧张素系统（renin angiotensin system，RAS）在引起心肌肥厚的诸因素中具有重要的作用[4]，它可以维持血压、机体内环境的稳定平衡，也调节细胞的生长、分化，尤其调控多种慢性疾病的组织改建和器官重构[5]。RAS属于循环系统激素，其中关键物质是血管紧张素Ⅱ（AngⅡ），它是重要的促心肌肥厚因子，具有强烈的收缩血管作用[6]，其亚型血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1）的活化参与了AngⅡ的大部分生物学效应。因此研究AT1发挥作用的机制及其受体拮抗剂的作用，对于了解心肌肥厚的形成，制订合理的预防和逆转措施，有着极其深远的意义。

1 材料与方法

1.1实验动物与材料

雄性SD大鼠24只，体重150～170 g，6～8周龄，购自重庆腾鑫生物技术有限公司，所有动物均自由饮水和摄食，并给予人性化管理。AngⅡ购自美国SIGMA公司，DMP811由美国SIGMA公司赠送，2001型微量渗透泵购自美国健康医疗仪器国际公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型的建立及分组 将24只雄性SD大鼠随机分为4组，每组6只，适应性喂养1周后，水合氯醛腹腔注射麻醉，皮下分别给予装有生理盐水或AngⅡ的渗透微泵。①正常对照组：输注生理盐水（1 μl/h）；②AngⅡ组：输注AngⅡ[200 ng/（kg·d）]；③AngⅡ+DMP811组：输注AngⅡ+DMP811管饲[3 mg/（kg·d）]；④AngⅡ+培哚普利组：AngⅡ输注+培哚普利管饲[10 mg/（kg·d）]，直至术后1周处死。

1.2.2 血流动力学检测 分别于手术当天、第3天、第7天测量动物的体质量（body weight，BW），术后1周断头处死大鼠，取其心脏，去掉心房及残余组织，只留下心室。并用PBS缓冲液洗净心腔残存血液之后用滤纸吸干，称重，并计算心室质量（cardioc weight，CW）与大鼠体质量之比（cardioc weight/body weight，CW/BW）。立即液氮速冻，之后存于-70℃冰箱备用。

1.2.2 心肌AT1 mRNA检测 实时荧光定量反转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）检测大鼠心肌组织AT1 mRNA：标本解冻后，立即超声破碎细胞，装于EP管并置于冰上，于4℃条件下12 000 r/min离心10 min。取上清液转移至DEPC预处理的EP管中，室温放置5 min使样本充分裂解。采用Trizol法提取心脏组织RNA，在测量仪上定量，之后于-70℃保存。电泳结果显示三条RNA条带，分别为28S、18S、5S依次清晰递减，泳道上无明显弥散痕迹，说明总RNA提取完整无明显降解，满足后续实验要求。将组织中提取的总RNA以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物反转录成cDNA，根据目的基因序列设计探针和引物，在PCR仪上进行扩增。内参对照选定管家基因GAPDH，引物由TaKaRa公司合成并经质量检测。反应体系在FTC2000型荧光定量PCR仪上进行，反应条件：94℃预变性2 min，然后94℃变性20 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，进行45个循环。在PCR反应过程中，设定无cDNA样品的空白管作为阴性对照。AT1上游引物：5′-CACCTATGTAAGATCGCTT-3′；下游引物：5′-GATGATGATGCAGGTGACT-3′；扩增片段长度：162 bp；GADPH上游引物：5′-TGACATCAAGAAGGTGGTGA-3′；下游引物：5′-TCATACCAGGAAATGAGCTT-3′；扩增片段长度：177 bp。

1.2.3 荧光定量PCR 按10倍梯度将一待测cDNA样品稀释，在相同条件下进行PCR扩增，横坐标为样品拷贝数的对数，纵坐标为CT值，拟合AT1 mRNA及GAPDH的荧光定量PCR标准曲线。在目的基因和管家基因扩增效率一致的基础上，以2-ΔΔCT表示目的基因的相对表达量，CT值代表每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所进行的循环数。以各样本的CT值减去其对应的内参照基因GAPDH的CT值得到ΔCT值，取一个参照组的ΔCT值的平均值作为对照基准，用每个标本的ΔCT值减去参照组的ΔCT值，得到ΔΔCT。计算2-ΔΔCT值，并统计各组之间的差异性。2-ΔΔCT值的意义：每个样本的基因的表达是参照组的基因表达平均值的多少倍。

1.2.4 统计学处理 使用SPSS 13.0统计学软件，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较用t检验，多组间比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组心脏质量比较

输注AngⅡ7 d，AngⅡ组较对照组CW及CW/BW明显增加（P<0.05）；与AngⅡ+DMP811组、AngⅡ+培哚普利组相比CW及CW/BW也显著增加，差异具有统计学意义（P<0.05），而AngⅡ+DMP811组、AngⅡ+培哚普利组的CW及CW/BW差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。

2.2 各组心肌组织AT1 mRNA表达

输注AngⅡ7 d，对照组AT1 mRNA水平为8.680±9.53，AngⅡ组AT1 mRNA水平为16.033±13.71，AngⅡ+DMP811组AT1 mRNA水平为5.410±4.75，AngⅡ+培哚普利组AT1 mRNA水平为5.685±0.30，较对照组上调（84.5±3.0）%（P<0.01），DMP811、培哚普利与AngⅡ合用有效阻断AngⅡ诱导的AT1 mRNA的转录上调。

3讨论

RAS是体内重要的分泌系统，除循环RAS外，在心血管、肾脏、脑等组织中，还存在局部RAS。局部RAS主要通过自分泌或旁分泌参与机体功能调节[7]。RAS中的AngⅡ与心肌肥厚的发生关系极为密切。AngⅡ能促进细胞合成增生蛋白，此作用在心肌增生的早期信号传导过程中非常重要，它可以使血管强烈收缩，且在外周组织局部如肾上腺、心脏、肾脏和血管等均可自动产生AngⅡ，且AngⅡ通过其特异的AT1受体介导完成大部分心血管效应[8]。AT1受体及其下游的信号分子参与细胞增殖、迁移，最终导致血管壁及心肌增生肥厚[9]。本研究大鼠心肌肥厚机制也证实了这一点。心肌肥厚大鼠心室中AngⅡ及AT1 mRNA 的表达明显高于对照组。输注AngⅡ7 d可使大鼠CW、CW/BW增加，说明在整体动物内经AngⅡ短期作用后，AngⅡ可以直接诱导心肌重塑，进一步证实了除血压外其他的因素也可以引起心肌重塑。曾有报道在体外培养发现AngⅡ可以促心肌细胞生长和心脏间质细胞增生[10]，与本文结果相似。

本实验结果提示，活体动物AngⅡ使AT1基因表达上调，而这又进一步加强了AngⅡ引起的心肌重塑效应，两者有相互促进的作用。临床发现心肌重塑是一个持续进展的过程，因而通过探讨AT1的表达调控机制，可为如何阻断由AT1基因表达上调所引起的心肌重塑及最终的心肌肥厚提供指导。DMP811是一种新型的AT1受体拮抗剂。它可以阻断靶组织上的AT1受体，从而消除AngⅡ引起的种种不良作用，如心肌、血管重构、血管收缩和血压增高等[11]。它通过增加细胞间的缝隙连接，减低纤维化从而改善心力衰竭的冲动传导[12]。DMP811之所以能够阻止受体与AngⅡ结合，是由于其占据了AT1受体上的7个跨膜空间。本实验结果提示：AT1拮抗剂可延长和逆转心肌肥厚的发生，在逆转心肌肥厚同时也降低了心肌中的AngⅡ含量。培哚普利是ACEI类药物，有研究报道[13]，ACEI类药物通过两方面的共同作用，预防并减轻心肌肥厚的发生：①直接抑制作用，即ACEI类药物抑制心脏局部自行生成AngⅡ；②间接抑制作用，即ACEI类药物抑制心脏交感神经末梢释放儿茶酚胺，进一步使儿茶酚胺递质对α或β受体激活作用减弱。综合上述作用，ACEI类药物可改善心肌细胞的重塑，降低因心脏扩大引起的心力衰竭的发生率。本实验结果提示ACEI和AT1受体拮抗剂通过阻断RAS，抑制AngⅡ引起的AT1 mRNA表达上调，两者通过干预RAS，达到相同的目的——阻断心肌肥厚的发生。

从本研究结果可见，AngⅡ引起的生物学效应是由AT1介导的，它可以直接造成心肌肥厚。本实验结果提示：AT1表达水平的高低与AngⅡ所致的心脏质量的变化密切相关，提示在整体水平上，AngⅡ上调AT1的表达，从而进一步加剧心肌细胞的重塑作用。由此可见，在整体水平上研究如何调控AngⅡ及其受体AT1的基因表达机制对于防治心肌肥厚具有重要的理论和现实意义。

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（收稿日期：2013-05-16 本文编辑：魏玉坡）