黄芪甲苷对紫外线诱导皮肤成纤维细胞表达TGFβRⅡ与Smad7的影响

[摘要]目的：探讨黄芪甲苷对紫外线诱导皮肤成纤维细胞TGFβRⅡ、Smad7mRNA以及蛋白质表达的影响。方法：培养原代人皮肤成纤维细胞，UVA及UVB分别照射人成纤维细胞，黄芪甲苷进行干预，MTT法检测细胞增殖活性，以ELISA 法检测Smad7的生成量，半定量RT-PCR法检测TGFβRⅡ、Smad7 的mRNA表达，Western blot法检测TGFβRⅡ的蛋白表达。结果：不同浓度的黄芪甲苷干预组与正常对照组相比，成纤维细胞增殖活性随浓度增加而增强，药物浓度为40μg/ml时最显著（P<0.05）；UV辐射组与正常组相比，细胞上清液中Smad7蛋白含量明显增高，细胞内TGFβRⅡ的mRNA和蛋白表达均下降， Smad7mRNA表达增强；黄芪甲苷干预后，细胞上清液中Smad7蛋白含量下降，细胞内TGFβRⅡ的mRNA以及蛋白表达水平明显增高，Smad7mRNA表达下降（P<0.05）。结论：黄芪甲苷可能通过提高成纤维细胞的增殖活性，上调TGFβRⅡmRNA、蛋白水平以及下调Smad7 mRNA、蛋白水平的表达来对抗紫外线抑制TGF-β/Smad信号通路的传导，缓解皮肤光老化进程。

关键词：黄芪甲苷；人成纤维细胞；TGFβRⅡ；Smad7

[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2011）02-0225-04

Effect of Astragaloside on TGFβRⅡ and Smad7 expression in human skin fibroblasts induced by Ultraviolet

YAN Ning1,CHEN Bin1,LI Ran1,LI Shuang-feng1,BI Zhi-gang,ZHANG Yin-di2

(1.Department of Dermatology,The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029,Jiangsu,China;

2.Institute of Clinical Pharmacology,Nanjing Medical Vniversity)

Abstract:ObjectiveTo investigate effect of Astragaloside on the expression of TGFβRⅡ,Smad7 mRNA and protein in human skin fibroblast induced by Ultraviolet.MethodsCultured human skin fibroblasts were treated with different concentrations of Astragaloside. Cellular activity was detected by MTT assay. The secretions of Smad7 in cultured fibroblasts were detected by enzvme -linked immunoadsordent assay (ELISA). The mRNA levels of Smad7 and TGFβRⅡwere determined by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). The protein levels of TGF-βRⅡ was measured by Western blot assay.ResultsCompared with the control group, the increase of cell proliferation was observed followed the dosages-increased intervention of Astragaloside(P<0.05). The secretions and the mRNA expression of Smad7 were obviously increased, the protein expression and the mRNA levels of TGFβRⅡ was markedly decreased after UV irradiation comparing with the control group. After treated with Astragaloside, the secretions and mRNA expression of Smad7 were both decreased, the protein and the mRNA expression of TGFβRⅡwere both increased(P<0.05).ConclusionAstragaloside treatment may relieve the UV- damaged in the fibroblasts through elevating the cell proliferation activity and regulating the expression of related molecules in the TGF-β/Smad signaling pathway.

Key words: Astragaloside;human skin fibroblasts;TβR-Ⅱ;Smad7

紫外线(Ultraviolet，UV)引起的皮肤光老化最为重要的外观特征是皱纹形成，在组织学上主要表现为胶原成分减少和弹性纤维变性沉积等皮肤基质构成的改变。而紫外线辐射诱导真皮Ⅰ型胶原减少是皮肤光老化中皱纹形成的首要原因[1]。

TGF-β/Smad信号转导途径具有促进成纤维细胞增生以及细胞外基质成分合成的作用。TaiHao Quan等研究表明，紫外线辐射可改变TGF-β的跨膜信号传导，不仅可通过改变TGF-β的基因表达水平和下调TGFβRⅡ的水平直接影响TGF-β/Smads信号转导路径的信号传递，还可通过诱导机体内Smad7、AP-1、CYR61等信号分子的产生或活化而间接阻断TGF-β/Smads信号通路的信号转导， 从而影响成纤维细胞对胶原蛋白等细胞外基质蛋白的合成和分泌[2-3]。

中药提取物预防皮肤光老化的研究已有不少报道。 黄芪是我国常用的中药之一，具有抗氧化、抗炎等多方面药理作用。黄芪甲苷 (Astragaloside，As)为黄芪皂甙类单体成分，是黄芪的主要有效成分，在抗衰老抗氧化方面，有其独特的作用[4]。本实验以人原代成纤维细胞作为研究对象，UV辐射后，以黄芪甲苷直接作用于成纤维细胞，观察其对紫外线诱导皮肤成纤维细胞TGFβRⅡ、Smad7表达的影响，为黄芪甲苷抗皮肤光老化作用提供理论依据和实验基础。

1材料和方法

1.1 材料与试剂：SUV-100日光紫外线模拟器（上海SIGMA公司），128C型酶标仪（奥地利Clinibio公司），DMEM培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司），ELISA试剂盒（武汉优尔生科技股份有限公司），Trizol（美国Invitrogen公司），RT-PCR引物（上海英骏技术服务有限公司合成）， RT-PCR反应体系（大连宝生物有限公司），凝胶成像扫描系统分析仪（意大利Bio-Rad公司），一抗兔抗人TGFβRⅡ（millipore公司）、二抗羊抗兔（sant cruz公司），垂直电泳仪购、ECL 发光剂（美国 GE 公司），BCA试剂盒（碧云天公司），柯达活体成像仪 cymentre2000（美国 Kodak 公司），黄芪甲苷（江苏省中科学院植物研究所）。

1.2 原代人成纤维细胞培养：取健康儿童环切包皮，利用细胞培养法，加入含20%小牛血清的DMEM培养液，待成纤维细胞融合至80%～90%时消化传代，实验选用3～8代细胞。

1.3 药物的配置：取0.05g黄芪甲苷干粉溶于0.5ml二甲基亚砜 ( DMSO)， 配成浓度为100mg/ml的贮存液，-20℃保存，临用时用DMEM 培养液倍比稀释，使其终浓度分别为3、5、10、20、30、40、45、50μg/ml。

1.4 MTT法测细胞增殖活性及药物最适浓度：制备单细胞悬液，接种于96孔板中，等细胞贴壁生长至70%～80%时，加入不同浓度的黄芪甲苷，培养24h后换回无药物的培养基， 再向每孔(含100μl培养基)加入20μl浓度为5mg/ml的 MTT，孵育 4h，弃上清，加入150μl DMSO，置恒温振荡器内振荡10min，酶标仪测定各孔在490nm处吸光值(A值)，计算细胞活性以及选取最佳药物浓度。每种药物浓度4个复孔，重复3次试验。

1.5紫外线照射及实验分组：将细胞接种在直径10cm的培养皿中，用含10%FBS的DMEM培养液于37℃、5%CO2温箱孵育，待细胞生长至80%～90%时进行实验。实验分5组，A组 (正常对照组)：未经任何处理； B组（UVA照射组）；C组（UVB照射组）；D组（As+UVA组）：用黄芪甲苷孵育2h，弃去，PBS洗1次，再以UVA照射，照射后继续以含黄芪甲苷的DMEM培养；E组（As+UVB组）：用黄芪甲苷孵育2h，弃去，PBS洗1次，再以UVB照射，照射后继续以含黄芪甲苷的DMEM培养；以上加药组均以浓度为40μg/ml（经MTT所测得药物最适浓度）的黄芪甲苷处理，B组、D组以10J/cm2的UVA照射，C组、E组以30mJ/cm2的UVB照射，照光后各组均加入相应的无血清DMEM培养基继续培养24h后，收集细胞上清液用于ELISA，细胞用做RT-PCR及Western blot。

1.6 ELISA法检测细胞上清Smad7分泌量：加入黄芪甲苷干预24h后，收集上清液。严格按照试剂说明书进行。

1.7 半定量RT-PCR测定细胞TGFβRⅡ和Smad7mRNA表达变化：细胞总RNA提取严格按trizol提取液说明书进行，按照相应的PCR试剂盒逆转录合成cDNA；按以下引物进行RT-PCR扩增：

Smad7引物（301bp）

F-primer 5" -CCT CCT TAC TCC AGA TAC CCA -3"

R-primer 5" -GCT GAC TCT TGT TGT CCG AAT -3"TGFβRⅡ引物（81bp）

F-primer 5"-CTG CGT CTG GAC CCT ACT CTG T-3"

R-primer5"-TTC TGG AGC CAT GTA TCT TGC A-3"

β-actin做内参照引物（271bp）

F-primer 5"-CTA CAA TGA GCT GCG TGT GGC-3"

R-primer 5"-CAG GTC CAG ACG CAG GAT GGC-3"

扩增条件：预变性94℃5min； 变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃45s，循环35次；最后72℃7min延伸。最后取 PCR产物l0μl在2%琼脂糖凝胶中电泳，紫外凝胶成像系统扫描成像。

1.8 Western blot检测TGFβRⅡ的蛋白水平：于照光加药后24h收集各实验组细胞，以M- PERTM (Pierce)蛋白提取液分别处理细胞，收集细胞总蛋白，BCA法定量后经 SDS-PAGE，电转膜，免疫抗体反应，最后化学增强发光法(ECL)显带。

1.9 统计学处理：数据以（x±s）表示，用SPSS13.0统计软件对实验数据进行单因素方差分析，P<0.05有显著性差异。

2结果

2.1 黄芪甲苷对成纤维细胞增殖活性的影响：不同浓度黄芪甲苷干预后，结果显示：细胞活性随黄芪甲苷的浓度增加而增强，与正常对照组相比，药物浓度为40μg/ml时差异最显著（P﹤0.05），见图1。

2.2 黄芪甲苷对成纤维细胞细胞上清液中Smad7含量的影响：表1结果显示：UV照射组Smad7蛋白含量明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P﹤0.05），黄芪甲苷处理后，Smad7蛋白含量明显下降，与UV照射组相比差异显著（P﹤0.05）。（表1）。

2.3 黄芪甲苷对成纤维细胞TGFβRⅡ、Smad7mRNA表达的影响：结果如表2所示： UV组，TGFβRⅡmRNA相对表达量明显低于正常对照组，而Smad7 mRNA的相对表达量明显增高，与正常组相比有显著性差异（P﹤0.05）， 黄芪甲苷处理后， 细胞TGFβRⅡmRNA的相对表达量升高， Smad7mRNA的相对表达量明显降低，与UV组相比差异有统计学意义（P﹥0.05）（表2、图2、图3）。

2.4 黄芪甲苷对成纤维细胞TGFβRⅡ蛋白表达的影响：如图4b所示，UVA（10J/cm2）及UVB（30J/cm2）辐射的成纤维细胞（设为D组及E组）与正常培养的细胞相比，其TGFβRⅡ/β-actin比值降低，加入黄芪甲苷后TGFβRⅡ/β-actin比值增高，分别为D组的1.66倍，为E组的1.67倍，且与相应的UV组相比差异均有显著性（P<0.05）。见图4。

3讨论

成纤维细胞是真皮的主要功能细胞和结构基础，也是紫外线辐射的重要靶位之一， 经UV辐射后，不仅可使成纤维细胞的增殖活性降低，还可使细胞内一系列的信号传导出现异常，胶原蛋白合成减少，最终导致皮肤光老化。

转化生长因子-β（TGF-β）是一多功能的细胞生长调节蛋白。TGF-β可促进成纤维细胞增殖，使其合成胶原等细胞外基质成分的能力增强[5]。TGF-β超家族受体主要有Ⅰ型（ TGFβRⅠ）和Ⅱ型（TGFβRⅡ），都属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶跨膜受体。TGF-β的Ⅱ型受体（TGFβRⅡ）与TGF-β的Ⅰ型受体（TβRI）形成异源受体复合物一起介导TGF-β在细胞内的信号转导[6]。Smad蛋白被认为是介导TGF-β信号进入细胞核内的最重要的信号分子；Smad家族中Smad7对TGF-β/Smads途经的信号转导起负性调节作用[7]。TaiHao Quan等研究表明，UV 辐射成纤维细胞可下调TGFβRⅡ，影响对TGF-β的效应能力，干扰TGF-β依赖的I型前胶原基因表达以及蛋白的合成[2-8]，并能诱导Smad7在皮肤内表达，阻碍TGF-β/Smad信号传导通路，在皮肤成纤维细胞中TGF-β/Smad信号传导通路受阻，导致I 型前胶原合成减少，造成胶原丧失[2,9]。本实验亦证实紫外线辐射能引起成纤维细胞TGFβRⅡmRNA及蛋白表达下降，对于Smad7，UV照射同样可引起其mRNA及蛋白表达升高。本实验结果与国外报道一致。

黄芪甲苷为一种黄芪皂苷类单体成分，是黄芪制剂中的主要有效成分。王曦等[10]发现黄芪甲苷在较低浓度时可促进皮肤成纤维细胞增殖以及成纤维细胞I型胶原蛋白表达。本实验结果显示，不同浓度黄芪甲苷组与对照组相比，成纤维细胞的增殖活性均有所升高，并具有剂量依赖性，且药物浓度在40?g/ml时作用最明显，亦证实黄芪甲苷能够促进成纤维细胞增殖。近几年来还有报道，黄芪甲苷对紫外线辐射具有保护作用。 陈斌等[11]研究发现黄芪甲苷可通过促进皮肤角质形成细胞增殖以及减少细胞凋亡来减轻UVB辐射的损伤。王玫玲等[12]报道黄芪甲苷可显著抑制 UVA对成纤维细胞的氧化损伤，并能增强细胞的抗氧化防御能力。但黄芪甲苷能否通过激活TGF-β/Smad信号途径对抗紫外线辐射所致的皮肤光老化，至今尚无报道。本研究发现，紫外线辐射能引起成纤维细胞TGFβRⅡmRNA及蛋白表达下降，引起Smad7 mRNA及蛋白表达升高；而加入黄芪甲苷干预处理后，成纤维细胞TGFβRⅡmRNA和蛋白表达水平均增高， Smad7mRNA及蛋白表达水平均下降。由此结果，我们推测黄芪甲苷可能通过上调TGFβRⅡ以及下调Smad7的表达来对抗UV抑制TGF-β/Smad信号通路的传导， 从而促进成纤维细胞合成胶原蛋白。

黄芪甲苷作为一种植物活性成分， 可以通过多种途径抑制紫外线对皮肤的损伤。本实验研究结果表明，黄芪甲苷能显著抑制UV对体外培养的人成纤维细胞的光损伤，这一效应同黄芪甲苷促进成纤维细胞增殖和调节TGF-β/Smad信号传导密切相关。

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[收稿日期]2010-10-20 [修回日期]2011-01-06

编辑/张惠娟