4个绵羊品种FSHR基因多态性与生物信息学分析

材料与方法

1.1 材料

采集30只高山美利奴羊（甘肃省绵羊繁殖技术推广站）、30只中国美利奴羊（新疆巩乃斯种羊场）、30只敖汉细毛羊（内蒙古敖汉种羊场）、30只青海细毛羊（青海省三角城种羊场）共120只羊血样，每只羊颈部静脉采血5 mL于江苏宇力医疗器械有限公司EDTA-K2抗凝真空采血管中，每只綿羊分别采集2管血液样品，于-20 ℃冰箱冷冻保存，用于DNA提取。

1.2 方法

1.2.1 全基因组测序 4个绵羊品种共120只，分别对每只羊取1管血液并送至北京诺禾致源科技股份有限公司，提取DNA样品（试验过程中须无降解、无污染、无断裂等，以保证所提4个绵羊品种DNA纯度及完整性），经检测合格的4个绵羊品种的DNA样品分别每个样品取2 μg用于10×genomics平台建库，基于Illumina Hiseq平台进行双末端 150 bp 测序。根据2014年公布的绵羊参考基因组Oar_v 40（GCF_000298735.2），利用不同绵羊品种的测序结果序列reads，应用SOAPdenovo（诺禾自主研发软件）进行组装得到长的序列片段，然后利用lastz软件获得4个绵羊品种的每个个体全基因组信息，该试验由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。

1.2.2 FSHR基因多态位点筛选 将120个未分群未过滤的SNP vcf文件按照4个品种（高山美利奴羊、青海细毛羊、中国美利奴羊、敖汉细毛羊）进行分群，所用软件为vcftools_v 0114。将分好群的SNP文件进行过滤，过滤条件为：单个样本测序覆盖深度>2、maf（最小等位基因频率）>0.05、mis（缺失）<0.1。根据FSHR基因位置信息：Chromosome 2，NC_000002.12 （48953161-49154527，complement），利用 vcftools_v 0.1.14软件进行4个绵羊品种FSHR基因外显子SNP位点的提取，然后统计各个品种FSHR基因外显子SNP位点数，利用A-NNOVAR软件将各个品种FSHR基因外显子SNP位点进行注释。

1.2.3 FSHR基因多态位点遗传多样性分析 通过生物学分析软件POPGEN 1.32软件统计4个绵羊品种FSHR基因各SNPs位点的野生型、杂合型及突变纯合型的基因型频率、野生型和突变型等位基因频率、Hardy-Weinberg平衡检验，利用群体多态信息含量（PIC）计算程序计算4个绵羊品种FSHR基因各SNPs位点遗传多样性参数多态信息含量（PIC）。

1.2.4 生物信息学分析 4个绵羊品种FSHR基因由于SNPs产生了不同的基因型。利用RNA二级结构分析软件RNAfold进行4个绵羊品种不同基因型的FSHR基因RNA二级结构预测;利用NPSA软件中的MLRC程序进行4个绵羊品种不同基因型的FSHR基因蛋白质二级结构预测;利用蛋白质三级结构预测软件SWISS-MODEL进行4个绵羊品种不同基因型的FSHR基因蛋白质三级结构预测。

2 结果与分析

2.1 4个绵羊品种FSHR基因外显子SNPs筛选

根据4个绵羊品种共120只羊的全基因组测序结果与绵羊参考基因组比对分析4个绵羊品种FSHR基因外显子上存在的多态位点，高山美利奴羊FSHR基因外显子上共发现3个SNPs，包括2个转换位点（C→T、G→A）和1个颠换位点（T→G）;中国美利奴羊FSHR基因外显子上共发现7个SNPs，包括6个转换位点（3个G→A、2个T→C和1个C→T）和1个颠换位点（T→G）;敖汉细毛羊INHA外显子上FSHR基因外显子上共发现6个SNPs，包括5个转换位点（2个G→A、2个T→C和1个C→T）和1个颠换位点（T→G）;青海细毛羊FSHR基因外显子上没有发现突变。通过对4个绵羊品种FSHR基因外显子氨基酸序列进行分析发现，高山美利奴羊发生了3个错义突变，中国美利奴羊存在2个同义突变T817C、T1234C和5个错义突变G149A、G813A、T904G、C975T、G1572A，敖汉细毛羊存在2个同义突变T817C、T1234C和5个错义突变G149A、G813A、T904G、C975T、G1572A，4个绵羊品种FSHR基因外显子均不存在无义突变（表1）。

2.2 4个绵羊品种多态位点统计学分析

根据4个品种共120只羊的全基因组测序结果分析高山美利奴羊FSHR基因外显子SNPs位点基因型频率、基因频率、Hardy-Weinberg平衡状态检测（χ2、P值）、群体多态信息含量（PIC）计算结果。高山美利奴羊FSHR基因外显子上检测到的T904G、C975T、G1572A均表现出野生型和突变杂合型2种基因型，野生型基因型频率均高于突变杂合型基因型频率，野生型等位基因T、C、G分别为优势等位基因，均表现为低度多态。中国美利奴羊FSHR基因外显子上检测到的G149A、T904G、C975T、T1234C、G1572A表现出野生型和突变杂合型2种基因型，野生型基因型频率均高于突变杂合型基因型频率，野生型等位基因G、T、C、T、G分别为优势等位基因，均表现为低度多态;中国美利奴羊FSHR基因外显子上检测到的G813A、T817C表现出野生型、突变杂合型和突变纯合型3种基因型，G813A野生型基因型频率高于突变杂合型与突变纯合型基因型频率和等位基因G为优势等位基因，T817C突变杂合型基因型频率高于野生型与突变杂合型基因型频率和等位基因C为优势等位基因，G813A、T817C都表现为中度多态。敖汉细毛羊FSHR基因外显子上检测到的T904G、C975T、G1572A表现出野生型和突变杂合型2种基因型，野生型基因型频率均高于突变杂合型基因型频率，野生型等位基因T、C、G分别为优势等位基因，均表现为低度多态。敖汉细毛羊FSHR基因外显子上检测到的G813A、T817C、T1234C表现出野生型、突变杂合型和突变纯合型3种基因型，G813A和T1234C野生型基因型频率高于突变杂合型与突变纯合型基因型频率和等位基因G、T分别为优势等位基因，T817C突变杂合型基因型频率高于野生型与突变杂合型基因型频率和等位基因C为优势等位基因，G813A、T817C和T1234C都表现为中度多态;高山美利奴羊、中国美利奴羊和敖汉细毛羊FSHR基因外显子上检测到的所有突变位点χ2值均未达到显著水平（P>0.05），说明3个绵羊品种FSHR基因外显子上检测到的所有突变位點均达到Hardy-weinberg平衡状态（表2）。

2.3 FSHR基因的RNA二级结构分析

利用RNA二级结构分析软件RNAfold预测3个绵羊品种不同基因型的FSHR基因mRNA二级结构，结果（图1），表明G149A、C975T、G1572A位点的突变不会导致最小自由能的改变，G149A、C975T、G1572A位点的变异也不会导致mRNA二级结构的改变;G813A位点的突变最小自由能增加，结构稳定性降低，G813A未导致mRNA二级结构的改变;T817C、T904G和T1234C位点的突变均导致FSHR基因最小自由能改变，其中T817C导致FSHR基因RNA二级结构最小自由能降低，二级结构稳定性增加，T904G和T1234C位点的突变导致FSHR基因RNA二级结构最小自由能增加，二级结构稳定性降低，T817C、T904G和T1234C位点的突变导致FSHR基因mRNA二级结构的改变。

2.4 FSHR基因多态位点蛋白质二级结构预测

利用NPSA软件中的MLRC程序进行4个绵羊品种不同基因型的FSHR基因蛋白质二级结构的预测，结果表明，FSHR基因编码蛋白质为全α蛋白，不存在β-转角。错义突变G149A位点使编码蛋白质无规则卷曲所占比例减少，扩展链所占比例增加，α-螺旋所占比例不变;错义突变G813A位点使编码蛋白质α-螺旋所占比例减少，无规则卷曲与扩展链所占比例增加;错义突变位点T904G使编码蛋白质无规则卷曲与α-螺旋所占比例减少，扩展链所占比例增加;错义突变位点C975T使编码蛋白质无规则卷曲所占比例减少，α-螺旋与扩展链所占比例增加;错义突变位点G1572A使编码蛋白质无规则卷曲与扩展链所占比例减少，α-螺旋所占比例增加。

2.5 FSHR基因多态位点蛋白质三级结构预测

利用蛋白质三级结构预测软件SWISS-MODEL进行3个绵羊品种不同基因型的FSHR基因蛋白质三级结构的预测，结果表明，3个绵羊品种各错义突变位点导致FSHR基因蛋白质三级结构发生明显改变，与蛋白质二级结构预测结果相一致。

3 讨论

羊的繁殖性状是影响羊养殖业的重要经济性状，直接影响绵羊养殖业的生产成本与生产效益，限制绵羊养殖业的发展，因此提高绵羊的繁殖性能对畜牧业的发展具有十分重要的意义[11]。大量研究表明，FSHR与哺乳动物的繁殖性状有密切的关系，例如雌性动物卵巢功能[12-13]、卵泡生长发育[14]和雌性动物睾丸发育[15]、精子发生[16]、精子活力与精液质量[17-19]等。近年，关于哺乳动物FSHR基因多态性与多胎性状之间的关系研究较多。许瑶等研究猪FSHR基因外显子10的多态性与产仔数间的关联分析发现，FSHR基因可作为提高猪产仔数的分子标记[8]。陈祥等对220只产羔记录完整的黔北麻羊FSHR基因SNPs位点的不同基因型与繁殖性状进行分析，在C1246A位点，黔北麻羊群体中BB型个体的产羔数与AA型和AB型差异显著（P<0.05）[10]。Pan等对FSHR基因的5′侧翼区与产羔数进行关联分析，发现绵羊FSHR基因与绵羊产羔数极显著相关（P<0.01），CC的基因型比TC和TT多0.42（P<0.01）和0.53（P<0.01），表明绵羊FSHR基因可以作为提高绵羊产羔数候选基因[20]。

由上述研究可推测，FSHR基因多态性与高山美利奴羊、青海细毛羊、中国美利奴羊、敖汉细毛羊的多胎性状也存在相关性。本研究通过分析4个品种全基因组测序结果，首次对4个绵羊品种FSHR的全外显子的单核苷酸多态性进行研究。研究发现，高山美利奴羊FSHR基因在外显子上存在3个多态位点（T904G、C975T、G1572A），中国美利奴羊FSHR基因在外显子上存在7个多态位点（G149A、G813A、T817C、T904G、C975T、T1234C、G1572A）、敖汉细毛羊FSHR基因在外显子上存在6个多态位点（G813A、T817C、T904G、C975T、T1234C、G1572A）。4个品种之间检查结果与龙威海等对黔北麻羊FSHR基因的检测结果[21]及王惠娥等对多浪羊和卡拉库尔羊FSHR基因的检测结果[22]存在差异，可能是由地域不同造成的自然选择不同或者是品种的不同造成的。基因外显子编码氨基酸序列，外显子上的单核苷酸突变可能会造成RNA二级结构、蛋白质二级结构、蛋白质三级结构改变，进而对其生物学功能造成影响[23]。本研究所检测7个SNPs中T817C、T904G、T1234C既使mRNA的二级结构发生改变，又改变了最小自由能，G813A只改变最小自由能，mRNA二级结构未发生改变，G149A与C975T、G1572A既没有使最小自由能发生改变，又没有改变mRNA的二级结构。碱基突变会导致蛋白质二级结构发生改变，本研究对4个品种所检测的7个多态位点中5个错义突变位点（G149A、G813A、T904G、C975T、G1572A）进行蛋白质二级结构分析发现，5个突变位点会导致 α-螺旋、无规则卷曲、扩展链的比例发生改变，进一步分析蛋白质三级结构发现错义导致蛋白质三级结构的改变，对FSHR基因功能是否造成影响还需要进一步的试验研究。

本试验为高山美利奴羊、青海细毛羊、中国美利奴羊、敖汉细毛羊的FSHR基因多态性与多胎性相关性的研究提供了参考，后续试验研究将进一步分析试验结果中的各品种FSHR基因SNPs位点与绵羊多胎性状相关性，研究FSHR基因多态性对绵羊产羔数的影响。

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