华蟾毒配基抑制组蛋白乙酰化诱导肝癌细胞死亡的机制

[摘要] 目的 探讨华蟾毒配基通过改变表观遗传修饰调控肝癌细胞死亡的机制。 方法 通过CCK-8法检测不同浓度（0、0.75、1.5、2.5、5、10 μmol/L）华蟾毒配基作用于肝癌HepG2细胞24 h细胞增殖能力的变化；5 μmol/L华蟾毒配基作用HepG2细胞12、24 h后，流式细胞术检测细胞周期，蛋白印迹检测钙/钙调素依赖蛋白激酶2β（CaMK2B）、甲基化CpG结合蛋白2（MeCP2）、磷酸化MeCP2（p-MeCP2）、乙酰化组蛋白H3.1（Ac-Histone3.1）和甲基化组蛋白（Met-Histone3.1）的表达变化；5 μmol/L华蟾毒配基作用HepG2细胞24 h后，细胞免疫荧光结合扫描共聚焦检测CaMK2B和MeCP2相互作用。 结果 华蟾毒配基能显著抑制肝癌HepG2细胞生长，抑制效果呈现浓度依赖性，差异有统计学意义（P < 0.05），药物作用细胞后，细胞周期发生G2/M期阻滞，差异有统计学意义（P < 0.05）。5 μmol/L華蟾毒配基可促进CaMK2B和MeCP2在细胞核内结合，Western blot 结果显示华蟾毒配基作用HepG2细胞后上调CaMK2B和p-MeCP2表达（P < 0.05），抑制Ac-Histone3.1表达，促进Met-Histone3.1（P < 0.05）。 结论 华蟾毒配基通过激活CaMK2B-MeCP2信号通路抑制组蛋白乙酰化、促进甲基化继而诱导肝癌细胞死亡。

[关键词] 华蟾毒配基；肝细胞癌；钙调蛋白激酶；表观遗传

[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）08（b）-0004-05

[Abstract] Objective To investigate the mechanism of cinobufagin in regulating the death of liver cells by regulating epigenetic modification. Methods The CCK-8 assay was used to detect the changes of proliferation ability after different concentrations （0， 0.75， 1.5， 2.5， 5， 10 μmol/L） of cinobufagin acting on the HepG2 cells for 24 h； after 5 μmol/L of cinobufagin acting on the HepG2 cells for 12， 24 h， the cell cycle was detected by flow cytometry， and the expression levels of Ca2+/Calmodulin-dependent protein kinase 2β （CaMK2B）， methylated-cpg binding protein （MeCP2）， phosphorylation-MeCP2 （p-MeCP2）， acetylated histone H3.1 （Ac-Histone3.1） and methylated histones （Met-Histone3.1） were detected by Western blot； after 5 μmol/L of cinobufagin acting on the HepG2 cells for 24 h， the interaction between CaMK2B and MeCP2 in HepG2 cells was detected by cell immunofluorescence combined with confocal scanning. Results Cinobufagin could inhibit the growth of HepG2 cells in a dose-independent manner， the difference was statistically significant （P < 0.05）， after the drug acting on the cells， the cell cycle comes up G2/M phase arrest， the difference was statistically significant （P < 0.05）. 5 μmol/L of cinobufagin could promote the incorporation of CaMK2B and MeCP2 in cell nucleus， the results of Western blot showed that the cinobufagin could increase the expression of CaMK2B and MeCP2 after acting on HepG2 cells （P < 0.05）， inhibit the expression of the Ac-Histone3.1， and promote the Met-Histone3.1 （P < 0.05）. Conclusion Cinobufagin can induce the death of liver cells by activating the CaMK2B-MeCP2 signal path， inhibiting histone acetylation and promoting histone methylation.

[Key words] Cinobufagin； Hepatocellular carcinoma； Calmodulin kinase； Epigenetic

蟾酥的主要成分是华蟾毒配基等，与植物來源的哇巴因和地高辛等均属于强心苷类固醇物质（cardiotonic steroids，CSs）[1-3]。CSs是钠钾ATP酶抑制因子，可以增加细胞内Na+浓度，间接促进细胞内Na+和细胞外Ca2+的交换，导致细胞内Ca2+浓度增加，增强心肌收缩力[4-5]。值得关注的是，国外20年的流行病学研究发现，激素敏感型癌症（宫颈癌和乳腺癌）患者术后服用强心苷类固醇药物地高辛拮抗化疗诱发的心力衰竭，能够使患者5年死亡率从34%显著降低至6%[6]。CSs也能激活Ca2+信号途径诱导肿瘤抑制基因（tumor suppressor genes，TSGs）重编程发挥抗癌作用[7]。我们前期研究结果显示，华蟾毒配基能够显著改变肝癌细胞DNA分子的拓扑结构，引起染色体重塑，参与基因转录表达的重新编程[8]。然而具体机制尚不明确，因此，我们推测华蟾毒配基可能通过改变肝癌细胞表观遗传发挥抗癌机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 人肝癌细胞株HepG2：中国科学院上海生命科学院细胞资源中心。

1.1.2 药物与试剂 华蟾毒配基（C1272，Sigma公司）；胎牛血清（12483020）、高糖培养基（11995073）、胰蛋白酶（25300062）、FITC和TRITC标记的荧光二抗（A10530和T-2769）购自于Thermo-Fisher公司；兔抗人单克隆抗体钙/钙调素依赖蛋白激酶2β（CaMK2B）（ab71709）、磷酸化甲基化CpG结合蛋白（p-MecP2）（ab2828）、乙酰化组蛋白H3.1（Ac-Histone3.1）（ab 4729）、甲基化组蛋白（Met-Histone）（ab8580）和组蛋白Histone H3.1（ab12079）、小鼠抗人MeCP2抗体（ab 50005）购自于Abcam公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔（5210-0176）、羊抗小鼠二抗（5230-0364）和ECL显影液（5430-0042）购自于KPL公司；CCK-8（40203ES60）、DMSO（60313ES60）、DAPI（40728ES03）和细胞周期检测试剂盒（40301ES50）购自于上海翊圣生物科技有限公司，其他常规试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人肝癌细胞株HepG2为贴壁生长细胞，常规培养于含有10%胎牛血清、1%青链霉素抗生素H-DMEM培养基中，细胞融合度达到85%时，常规0.25%胰酶消化细胞传代培养，每隔36 h换液。细胞培养环境条件为5%CO2、37℃和饱和湿度。

1.2.2 CCK-8法检测华蟾毒配基对HepG2增殖的影响 取对数生长期HepG2细胞株，常规消化为单细胞悬液，以每孔5000个/100 μL接种于96孔板培养24 h后，每孔加入不同浓度华蟾毒配基（0、0.75、1.25、2.5、5、10 μmol/L），继续常规培养24 h，每孔加入10 μL CCK-8试剂，37℃培养箱中孵育3 h，用酶标仪在激发波长450 nm处检测吸光度值，计算细胞生长抑制率：存活率（%）=（A实验-A空白）/（A对照-A空白）×100%。计算华蟾毒配基半数有效抑制浓度IC50值。

1.2.3 流式细胞术检测细胞周期 实验分组：5 μmol/L华蟾毒配基作用0、12、24 h。常规收集细胞，0.25%胰酶消化细胞收集到离心管，1000 g离心10 min，弃上清，加入预冷PBS再次离心，弃上清，用75%冷乙醇固定，上机前离心弃上清，PBS洗1次，过300目筛网，加入100 μg/mL RNase，40 μg/mL碘化丙啶（PI），0.2% Triton X-100避光孵育30 min，流式细胞仪检测细胞周期。用Flowjo软件对流式结果进行分析处理。

1.2.4 细胞免疫荧光华蟾毒配基对CaMK2B和MeCP2相互作用的影响 取对数生长期HepG2细胞株，常规消化为单细胞悬液，以1×104个/mL接种于共聚焦平皿中24 h后，加入5 μmol/L华蟾毒配基作用12、24 h后，PBS小心去除血清，清洗细胞，用70%甲醇溶液4℃固定细胞30 min，0.5% Triton X-100孵育15 min破细胞膜，5%山羊血清封闭1 h，分别标记兔抗人单克隆抗体CaMK2B（1∶200稀释），小鼠抗人MeCP2抗体（1∶150稀释）4℃孵育过夜，PBST清洗3次，每次10 min，分别标记抗兔FITC标记荧光二抗和抗小鼠TRITC标记荧光二抗（1∶200稀释）。PBST清洗3次，每次10 min。用10 μg/mL DAPI复染细胞核。莱卡扫描共聚焦显微镜检测荧光，FITC激发波长488 nm，TRITC激发波长552 nm，DAPI激发波长405 nm。荧光强度分析采用Image-Pro Plus 6.0软件。

1.2.5 Western blot检测细胞表观遗传相关蛋白的表达 将对照组细胞和华蟾毒配基加药处理12、24 h后细胞，0.25%胰酶消化细胞，1200 g离心10 min收集细胞，弃上清。每25平方厘米细胞培养瓶细胞加入RIPA裂解液（含有蛋白酶抑制剂），非接触式超声4℃破碎细胞，工作5 s，间歇5 s，共30个循环，14 000 g离心10 min，收集上清液。BCA定量法检测蛋白浓度，以60 μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳，半干转膜法转移至0.22 μm硝酸纤维素膜上。5%脱脂奶粉封闭1 h，加入1∶1000稀释的一抗4℃孵育过夜，PBST溶液洗膜3次，每次10 min，加入1∶10 000稀释的二抗常温孵育1 h，PBST溶液洗膜3次，每次10 min，ECL液化学发光，暗室曝光显影，用Scion Image软件进行灰度值分析，β-actin作为胞浆蛋白校正内参，Histone H3.1作为核蛋白校正内参。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0軟件包进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用ANOVA方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 华蟾毒配基对HepG2细胞增殖活性的影响

CCK-8结果显示，不同浓度（0.75、1.25、2.5、5、10 μmol/L）华蟾毒配基作用HepG2细胞24 h后，细胞生长抑制率分别为（75.9±8.2）%、（71.9±7.5）%、（61.9±6.8）%、（51.7±4.1）%和（39.7±8.2）%。华蟾毒配基对肝癌HepG2细胞生长有明显的抑制作用，且呈现浓度依赖性（F = 6.37，P < 0.05）。华蟾毒配基作用HepG2细胞24 h的IC50值为5.1 μmol/L。见图1。

2.2 华蟾毒配基对HepG2细胞周期的影响

细胞周期结果显示，对照组处于G2/M期细胞的比例为（16.17±2.77）%，5 μmol/L华蟾毒配基作用12 h后处于G2/M期细胞的比例为（31.14±5.48）%，作用24 h处于G2/M期细胞的比例为（49.14±6.48）%。细胞周期结果显示，华蟾毒配基能够引发HepG2细胞周期发生G2/M期阻滞，且呈现作用时间依赖性（F = 8.32，P < 0.05）。见图2。

2.3 华蟾毒配基对CaMK2B和MeCP2相互作用的影响

细胞免疫荧光结果显示，对照组细胞绿色荧光CaMK2B和红色荧光MeCP2在细胞核和细胞胞浆中均有显著的共定位关系，呈现明亮且均匀分布的共定位关系，当华蟾毒配基作用HepG2细胞24 h后，红色与绿色荧光集中于细胞核边缘，且荧光密度与对照组比较显著增加（t = 7.03，P < 0.05），结果提示华蟾毒配基能促进CaMK2B和MeCP2在细胞核内发生相互作用。见图3（封三）。

2.4 华蟾毒配基对肝癌细胞HepG2中CaMK2B和MeCP2表达的影响

Western blot结果显示，经过华蟾毒配基作用12、24 h后，CaMK2B和p-MeCP2水平均显著增加，差异有统计学意义（F = 8.32，P < 0.05），且呈现作用时间依赖性（F = 5.37，P < 0.05），而MeCP2表达无统计学意义（P > 0.05）。见图4。

2.5 华蟾毒配基对肝癌细胞HepG2表观遗传作用相关分子表达的影响

Western blot结果显示，经过华蟾毒配基作用12、24 h后，组蛋白乙酰化水平显著降低，差异有统计学意义（F = 6.32，P < 0.05）；组蛋白甲基化水平显著增加，差异有统计学意义（F = 9.41，P < 0.05）。见图5。

3 讨论

肝细胞癌是全球第三大恶性肿瘤，也是人类肿瘤相关死亡的第二大原因[9]。肝癌发现即晚期，失去手术治疗机会，因此，选择有效治疗肝癌的靶基因和治疗药物具有重要的意义。

华蟾毒配基作为从中药蟾酥中提取的活性成分，是一种强心苷类固醇类物质，作为钠钾泵的天然抑制剂，具有良好的抗肿瘤活性，且毒性低，副作用小。研究显示，人肝癌组织中钠钾ATP酶呈现高表达状态。肿瘤组织与正常组织中NKA表达状态的差异化，为以华蟾毒配基为代表的蟾酥活性成分提供了潜在的药物作用靶点[10]。前期研究显示，华蟾毒配基可引起肝癌细胞内游离Ca2+浓度显著升高，诱导细胞凋亡，因此我们推测华蟾毒配基可激活肝癌细胞钙信号介导细胞死亡[11]，当前研究发现华蟾毒配基作用肝癌HepG2细胞后能显著增加CaMK2B表达水平。CaMK2B是CaMK家族的重要一员，属于多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在调节肿瘤细胞生长、增殖速度、细胞周期、凋亡率和细胞侵袭性等生物学行为中发挥着重要作用[12]；同时CaMK2B也参与肿瘤细胞钙离子稳态以及与组蛋白去乙酰化酶9（HDAC9）结合催化组蛋白的去乙酰化进程，参与癌/抑癌相关基因转录表达过程[13-16]。而MeCP2蛋白是甲基化结合蛋白家族中的主要成员，与组蛋白去乙酰化酶复合物直接相互作用，同时利用其对甲基化DNA的特异性识别，间接促进染色体组蛋白的去乙酰化，易化DNA的甲基化封闭过程，抑制下游抑癌基因的转录[17-20]。当前研究提示，华蟾毒配基能促进肝癌细胞CaMK2B和MeCP2之间的相互作用，且上调CaMK2B和p-MeCP2表达，此时与染色体结合的MeCP2减少，抑制染色体组蛋白乙酰化，促进组蛋白甲基化。

综上所述，华蟾毒配基可能通过激活CaMK2B-MeCP2信号通路抑制细胞组蛋白乙酰化诱导肝癌细胞死亡。

[参考文献]

[1] Davison EK，Sperry J. Alkaloids from the Traditional Chinese Medicine ChanSu：synthesis-enabled structural reassignment of bufopyramide to bufoserotonin C [J]. Org Biomol Chem，2015，13（29）：7911-7914.

[2] 王佳宝，徐忠伟，王志美，等.蟾酥活性成分下调极光激酶表达并促进肝癌细胞周期阻滞的机制研究[J].中草药，2017，48（18）：3796-3801.

[3] 徐忠伟，王凤梅，王聪聪，等.钠钾ATP酶抑制剂通过调节DNA损伤感应复合体Mre11/Rad50/Nbs1的表达诱导肝癌HepG2细胞周期阻滞[J].中国药理学通报，2016， 32（3）：323-327.

[4] 王志美，徐忠伟，王佳宝，等.蟾酥活性成分协调索拉非尼通过下调Akt/NF-κB信号途径抑制肝癌HepG2细胞生长[J].中国药理学通报，2017，33（11）：1510-1516.

[5] Kim N，Yim HY，He N，et al. Cardiac glycosides display selective efficacy for STK11 mutant lung cancer [J]. Sci Rep，2016，6：29721.

[6] Karasneh RA，Murray LJ，Cardwell CR. Cardiac glycosides and breast cancer risk：A systematic review and meta-analysis of observational studies [J]. Int J Cancer，2017， 140（5）：1035-1041.

[7] Prassas I，Karagiannis GS，Batruch I，et al. Digitoxin-induced cytotoxicity in cancer cells is mediated through distinct kinase and interferon signaling networks [J]. Mol Cancer Ther，2011，10（11）：2083-2093.

[8] Xu Z，Wang F，Fan F，et al. Quantitative Proteomics Reveals That the Inhibition of Na（+）/K（+）-ATPase Activity Affects S-Phase Progression Leading to a Chromosome Segregation Disorder by Attenuating the Aurora A Function in Hepatocellular Carcinoma Cells [J]. J Proteome Res，2015，14（11）：4594-4602.

[9] Clark T，Maximin S，Meier J，et al. Hepatocellular Carcinoma：Review of Epidemiology，Screening，Imaging Diagnosis，Response Assessment，and Treatment [J]. Curr Probl Diagn Radiol，2015，44（6）：479-486.

[10] Xu ZW，Wang FM，Gao MJ，et al. Targeting the Na（+）/K（+）-ATPase alpha1 subunit of hepatoma HepG2 cell line to induce apoptosis and cell cycle arresting [J]. Biol Pharm Bull，2010，33（5）：743-751.

[11] Xu ZW，Wang FM，Gao MJ，et al. Cardiotonic steroids attenuate ERK phosphorylation and generate cell cycle arrest to block human hepatoma cell growth [J]. J Steroid Biochem Mol Biol，2011，125（3-5）：181-191.

[12] Nakanishi A，Hatano N，Fujiwara Y，et al. AMP-activated protein kinase-mediated feedback phosphorylation controls the Ca2+/calmodulin（CaM）dependence of Ca2+/CaM-dependent protein kinase kinase β [J]. J Biol Chem， 2017，292（48）：19804-19813.

[13] York B，Li F，Lin F，et al. Pharmacological inhibition of CaMKK2 with the selective antagonist STO-609 regresses NAFLD [J]. Sci Rep，2017，7（1）：11793.

[14] Chen X，Wu Q，You L，et al. Propofol attenuates pancreatic cancer malignant potential via inhibition of NMDA receptor [J]. Eur J Pharmacol，2017，795：150-159.

[15] Marcelo KL，Means AR，York B. The Ca（2+）/Calmodulin/CaMKK2 Axis：Nature′s Metabolic CaMshaft [J]. Trends Endocrinol Metab，2016，27（10）：706-718.

[16] Raynal NJ，Lee JT，Wang Y，et al. Targeting Calcium Signaling Induces Epigenetic Reactivation of Tumor Suppressor Genes in Cancer [J]. Cancer Res，2016，76（6）：1494-1505.

[17] Mushtaq AU，Lee Y，Hwang E，et al. Biophysical characterization of the basic cluster in the transcription repression domain of human MeCP2 with AT-rich DNA [J]. Biochem Biophys Res Commun，2018，495（1）：145-150.

[18] Good KV，Martínez de Paz A，Tyagi M，et al. Trichostatin A decreases the levels of MeCP2 expression and phosphorylation and increases its chromatin binding affinity [J]. Epigenetics，2017，12（11）：934-944.

[19] Zhang J，Zhao J，Gao N，et al. MECP2 expression in gastric cancer and its correlation with clinical pathological parameters [J]. Medicine（Baltimore），2017，96（31）：e7691.

[20] Ohashi M，Korsakova E，Allen D，et al. Loss of MECP2 Leads to Activation of P53 and Neuronal Senescence [J]. Stem Cell Reports，2018，10（5）：1453-1463.

（收稿日期：2018-04-02 本文編辑：张瑜杰）