脂氢过氧化物裂解酶基因对生菜遗传转化的研究
~bjךayi,yh~R& {--yaz|ڞޮ{hmǛ+iv&yٞ <$ZԨ^v!vޞ ڊxZv,دz 'bͫb{"v t+hhmm.y.mg\^Vznq餧ݰ|^bujLJ< ۜxgz+b"M'M4۞Mzӝ4i'kz\,9,?tp9Ӊbrڱ_s,<_?rۜjƭw"-'&hsˤ 6M7!-9iըky"http://www.wufanghuizhong.com/p/cailiao/" target="_blank" class="keylink">材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 枸橘（Poncirus trifoliata）叶片采于中国科学院植物所香山植物园；生菜所用品种为‘美国大速生’，购自中国农业科学院蔬菜花卉研究所。
1.1.2 菌株和质粒 pMD18-T Vector购自TaKaRa公司；大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、 TOP10、 根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）Agl0、LBA4404和质粒pCAMBIA3300-35S-Tnos、pCAMBIA
2300均由北京大学生命科学学院林忠平实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 引物设计 根据NCBI上已知的金柑玛利亚HPL基因的相似序列，设计包括HPL基因起始密码子、终止密码子及相应酶切位点在内的1对引物，上游引物HPL-Sma Ⅰ-5′：TCCCCCGGGGGA
ATGAATGCCTCCATGATGATGATA（含SmaⅠ酶切位点），下游引物HPL-Kpn Ⅰ-3′：GGGGTACCC
CTCACTTGGCCTTTTCAACGG（含Kpn Ⅰ酶切位点）。设计用于检测转基因生菜的1对引物，上游引物HPL（枸橘）5′：ATGAATGCCTCCATGATGATG
ATA，下游引物HPL（枸橘）3′：TCACTTGGCCTTT
TCAACGG。所有引物合成及DNA测序工作均由上海生工生物工程有限公司完成。
1.2.2 pCAMBIA2300-35S-HPL-Tnos植物表达载体的构建 （1）通过引物设计在HPL基因两端引入酶切位点SmaⅠ和KpnⅠ，用限制性内切酶SmaⅠ和KpnⅠ双酶切质粒 pCAMBIA3300-35S-Tnos，回收载体大片段pCAMBIA3300-35S，将HPL基因片段插入pCAMBIA3300-35S的SmaⅠ和KpnⅠ酶切位点间，得到中间载体pCAMBIA3300-35S-HPL；（2）用限制性内切酶HindⅢ和EcoRⅠ双酶切质粒pCAMBIA3300-35S-Tnos和质粒pCAMBIA
2300，回收1 157 bp左右基因片段35S-Tnos和大片段pCAMBIA2300，将35S-Tnos片段插入pCAMBIA2300的HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点间，得到pCAMBIA2300-35S-Tnos载体；（3）用限制性内切酶HindⅢ和KpnⅠ双酶切上述试验获得的中间载体质粒pCAMBIA3300-35S-HPL和质粒pCAMBIA2300-35S-Tnos，回收2 376 bp左右的基因片段和pCAMBIA2300-Tnos大片段，将含回收到的2 300 bp左右的基因片段插入pCAMBIA2300-Tnos的HindⅢ和KpnⅠ酶切位点间，得到目的表达载体pCAMBIA2300-35S-HPL-Tnos（图1）。
1.2.3 农杆菌介导的生菜遗传转化 （1）生菜组织培养所用培养基及条件。植物基本培养基为MS培养基，pH=5.8，固体培养基含有0.8%琼脂。生菜组织培养所用培养基：共培养培养基SM1，MS+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA；再生培养基SM2，MS+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+500 mg/L Cb；筛选培养基SM3，MS+0.05 mg/L NAA+45 mg/L Kan+500 mg/L Cb；生根培养基SM4，MS+0.05 mg/L NAA。培养条件：光培养14 h/d，暗培养10 h/d，培养温度为23～28 ℃，光强为 1 200～1 400 lx 。
（2）农杆菌转化叶盘：①分别接种农杆菌转化子LBA4404和Agl0至20 mL的LB液体培养基（含Sm 100 mg/L、Rif 50 mg/L、Kan 100 mg/L）中，于28 ℃，190 r/min振荡培养36～48 h，期间活化2次；②按照1 ∶ 5的比例将菌液分别稀释至30 mL MS液体培养基中，于28 ℃，190 r/min振荡培养至OD600=0.4～0.6；③取长势健壮的生菜无菌组培苗的叶片，用剪刀剪成小块，放入农杆菌菌液中侵染10～15 min，期间不断轻摇几次充分侵染；④取出侵染好的小叶块，用灭过菌的干净滤纸吸干残留菌液，置于共培养培养基SM1中，28 ℃暗培养48 h；⑤共培养后，将叶片转移至再生培养基SM2中，28 ℃光照培养，使其形成愈伤组织，并分化出芽；⑥待芽长至2～3 cm时剪下，转移至筛选培养基SM3中，并对其进行Kan抗性筛选，筛选后再转入生根培养基SM4中诱导生根。
1.2.4 转基因植株的检测 （1）DNA提取及PCR检测：采用广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒提取生菜抗性植株和未转基因植株叶片的基因组DNA，以未转基因植株叶片的基因组DNA为对照，以HPL（枸橘）5′和HPL（枸橘）3′为引物进行PCR检测。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循环30次；最后72 ℃延伸10 min，10 ℃保温10 min，降至4 ℃保存。反应结束后，取PCR产物5 μL 进行琼脂糖凝胶电泳检测。
（2）Southern印迹杂交鉴定：采用Roche公司的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ试剂盒。随机选择PCR检测为阳性的8个株系进行Southern印迹杂交鉴定，用内切酶HindⅢ消化这8个株系的DNA。DNA酶切产物经1.0%琼脂糖凝胶60 V恒压下电泳4～6 h后，进行Southern杂交。
（3）RT-PCR检测：采用Trizol法提取上述鉴定呈阳性的生菜植株总RNA，用Invitrogen公司的反转录试剂盒获得cDNA，以cDNA为模板，以HPL（枸橘）5′和HPL（枸橘）3′为引物，进行PCR检测。
（4）Northern杂交检测：采用Trizol法提取上述鉴定呈阳性的生菜植株总RNA，取10 μL（约20 μg）甲酰胺溶解的RNA样品，依次加入5×MOPS 2 μL、甲醛3.5 μL、甲酰胺3.5 μL，充分混匀后，65 ℃水浴15 min，转至冰上冷却，稍离心后，加入2 μL 6×loading buffer，于50～60 V的甲醛凝胶电泳4～6 h，最后进行Northern杂交。
2 结果与分析
2.1 HPL基因的克隆及序列分析
以HPL-SmaⅠ-5′和HPL-KpnⅠ-3′为上、下游引物，以枸橘总RNA逆转录产物cDNA为模板，通过PCR 扩增反应，得到一条1 500 bp左右的基因片段（图2），回收、连接并转化，再经抗生素筛选及菌液PCR 筛选阳性克隆，选取具有目的条带的2号菌液测序。
测序结果经www.ncbi.nlm.nlh.gov网站中的BLAST分析，结果表明，HPL基因在芸香科植物中表现出了较高的同源性。从枸橘中所克隆的HPL基因序列与金柑玛格丽塔HPL基因序列（GenBank：GU997105.1）的同源性为99.13%，与柑橘克莱门基因序列的同源性为99%（GenBank：XM_006447537.1），与甜橙HPL基因序列的同源性为98.8%（GenBank：NM_001288924.1），
2.2 植物表达载体pCAMBIA2300-35S-HPL-Tnos的构建
提取重组质粒pCAMBIA2300-35S-HPL-Tnos并分析其酶切位点，选用KpnⅠ和SmaⅠ进行双酶切，结果显示，酶切片段的大小与克隆的HPL基因相符，表明目的基因HPL已经成功克隆至表达载体上，成功构建了表达载体pCAMBIA2300-35S-HPL-Tnos。
2.3 农杆菌介导的生菜遗传转化
将冻融法转化的农杆菌LBA4404和Agl0转化子在固体LB（含100 mg/L Kan、50 mg/L Rif以及100 mg/L Sm）平板上进行筛选鉴定，结果显示，表达载体pCAMBIA2300-35S-HPL-Tnos已经成功转入农杆菌LBA4404和Agl0中。根癌农杆菌侵染生菜植株叶片后，于共培养培养基上暗培养2 d后，转移至再生培养基上25～30 d，诱导分化出小苗，在含Kan的筛选培养基中初步筛选出长势健壮的植株进行下一步检测。
2.4 转基因生菜的检测
2.4.1 PCR鉴定 以抗性植株总DNA为模板，未转基因植株为阴性对照，表达载体pCAMBIA2300-35S-HPL-Tnos质粒作为阳性对照，ddH2O为负对照，分别在农杆菌LBA4404和Agl0侵染的抗性株系中随机选取48株，用HPL基因引物进行PCR扩增鉴定。结果表明，在48株抗性株系中，农杆菌LBA4404和Agl0侵染的阳性植株分别为31株和26株（图3，部分株系）。
2.4.2 Southern 印记杂交鉴定 用Southern杂交进一步验证PCR呈阳性株系，提取长势良好的阳性植株总DNA，用探针序列内没有的酶切位点HindⅢ进行消化（图4，部分株系），以非转基因植株DNA为阴性对照，进行杂交。分析结果显示，阳性植株均出现1 500 bp的杂交条带，而非转基因植株则没有，与PCR结果一致，这说明外源基因已经成功导入植株中（图5，部分株系）。
2.4.3 转基因植株的RT-PCR鉴定 转基因生菜在基因组水平对HPL基因进行鉴定后（PCR鉴定和Southern杂交），在转录水平上再用RT-PCR方法对HPL基因进行鉴定，检测外源HPL基因是否表达，对上述PCR鉴定呈阳性的植株进行总RNA的提取，用oligo dT作逆转录引物进行PCR，结果见图6。RT-PCR检测结果显示，转基因植株中均能扩增出长约1.5 kb的HPL特异条带，而非转基因植株中的cDNA模板则未克隆出该条带。
2.4.4 转基因植株Northern鉴定 通过Northern 杂交进一步确定外源基因的表达，选取上述鉴定出的阳性植株，提取植株的总RNA，以非转基因植株的RNA为阴性对照，进一步分析HPL基因在植株中的转录。结果表明，外源基因能够正常转录，而非转基因植株则未杂交出目的条带，这与RT-PCR结果一致（图7，部分株系）。
3 讨论与结论
HPL是植物脂氧化途径中脂氧合酶下游反应的关键酶，其催化产生醛或醇，不仅是果蔬特异性气味的重要组成部分，还与植物抗病虫、抗真菌及伤害反应有关[4，19-20]。通过基因工程手段将HPL基因转化到蔬菜中，有利于提高蔬菜的香气和自身抗逆性，对蔬菜品质改良具有重要意义。自1996年来自甜椒的第一个HPL基因完成克隆以来[1]，与此酶的相关研究逐渐受到人们重视。赵凌等[9]曾对植物HPL的生化特性和功能做过比较全面的评述，指出HPL的催化产物不仅是植物特异性气味的重要组成部分，同时也与植物的抗病虫性相关。Matsui等[8]的研究结果也显示HPL诱导物招引害虫的天敌也是一种间接的抗虫作用。Engelberth[10]等的研究结果表明通过某些化合物激发GLVs信号可达到抑制虫害的效果，可为新型农药的开发铺平道路。Ninkovic等[11]利用这方面的研究成果在抑制蚜虫对马铃薯的危害方面取得了一定的成果，中国农科院茶叶所将茶叶中的HPL基因导入番茄显著强化了番茄对病虫害的防御能力[12]。
在农杆菌菌株选择中，农杆菌菌株的侵染转化率在应用于不同植株时也有很大的差异，每种植株都存在其最适宜或最敏感的农杆菌菌株[21]。本研究使用2个不同农杆菌菌株（Agl0和LBA4404）侵染生菜进行遗传转化，分别从侵染的抗性株系中随机选取48株，对其进行PCR检测，结果表明不同农杆菌菌株的转化率不同，从农杆菌菌株Agl0筛选出26株阳性植株，从LBA4404筛选出31株阳性植株，转化率分别为54.2%（Agl0）和64.6%（LBA4404）。因此，农杆菌LBA4404菌株更适合作为生菜的遗传转化。
经过Kan筛选及多次PCR检测，初步证实了目的基因已经转入到植株中，然而，考虑到PCR可能受某些因素的影响造成假阳性，因此随机抽取6株PCR鉴定为阳性的生菜植株进行Southern杂交检测，结果6株生菜均为转基因株系，这表明外源基因HPL已经成功导入生菜植株中。为了进一步检测外源基因HPL能否在植物中正常表达，在转录水平上对上述阳性植株又进行了RT-PCR和Northern杂交检测，结果显示，外源基因HPL在生菜中能够正常转录。
本研究从气味较强的芸香科植物枸橘中克隆得到HPL基因，并构建表达载体pCAMBIA2300-35S-HPL-Tnos，利用农杆菌介导法将HPL基因导入生菜，并进行Kan筛选及多次PCR检测、Southern杂交检测、RT-PCR和Northern杂交检测获得转基因生菜，进一步的工作是将获得的转基因植株进行田间试验，检测HPL基因表达效果，并进行抗性试验，观察农艺性状、腺毛、气味成分的变化，同时进行后代遗传特性等研究。
参考文献
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