基因修饰的纳米纤维支架的研究进展

【摘要】纳米纤维支架以其良好的生物相容性和生物载体作用，在引导组织再生研究中的应用日益广泛，而将其与基因相结合应用于引导组织再生也成为组织工程研究的重要方向。本文就纳米纤维生物支架的种类和特性及合成，纳米纤维支架与基因结合的意义和方式，基因修饰的电纺纳米纤维膜的合成与结合，基因从纳米纤维支架中的释放，纳米纤维支架的应用和展望等研究进展作一综述。

【关键词】纳米纤维；组织工程；支架；引导组织再生；基因

【中图分类号】R783.1

【文献标志码】A

组织工程支架包括二维膜和三维支架，在引导组织再生（guided　tissue　regeneration，GTR）中起着重要的作用。组织工程支架一方面通过其空间形成能力，维护组织缺损和环境的稳定，为组织再生提供必要的条件；另一方面则通过在支架中添加活性物质，直接或间接地促进缺损愈合。纳米纤维结构的组织工程支架，以其取材广泛、性能可塑和结构可控成为近年来GTR研究的热点。组织工程支架加载的生物活性物质主要分为两类：其一是具有生物活性的蛋白质，如用于骨诱导形成的骨形态发生蛋白－2；其二则是基因，包括质粒和基因载体复合物。随着研究的深入，如何将基因工程技术与纳米支架结合，通过基因重组持续性地产生内源性活性物质，促进组织愈合成为GTR研究的新方向。

1　纳米纤维生物支架的种类和特性及合成

1.1纳米纤维支架的种类

纳米纤维组织工程支架材料来源复杂，既有碳纳米管等无机纳米材料，又有胶原和玻璃酸等天然有机材料，另外还有聚乙酸内酯－羟磷灰石（polycaprolactone-hydroxyapatite，PCL-HA）、胶原－羟磷灰石复合膜、左旋聚乳酸、聚醚砜和聚苯胺－间氨基苯甲酸－聚乳酸等高分子纳米材料或复合材料。此外，还涉及单壁碳纳米管－银纳米颗粒膜、PCL-二氧化硅、纳米羟磷灰石－聚酰胺6等。

1.2纳米纤维支架的特性

1.2.1较大的接触面积　纳米纤维支架具有较大的接触面积，可以提高细胞的亲和性，促进其黏附和增殖。Thapa等通过对比纳米结构与微米结构的聚乳酸－乙醇酸共聚物证实，膀胱平滑肌细胞在前者中具有更好的黏附性能。人间充质干细胞（mesenchymal　stem　cell，MSC）在纳米PCL上的黏附和迁移优于在微米尺度的PCL。

1.2.2改变细胞表型　Yim等证实，纳米结构可以促进MSC向神经系细胞分化。Li等则发现，相对于微米尺度的支架，在纳米支架上培养的软骨细胞有着更高的软骨基因和蛋白质表达。

1.2.3较高的孔隙率　纳米纤维支架具有较高的孔隙率，因而有利于营养供给和细胞迁移。纳米纤维支架较高的孔隙率和大孔径有利于骨组织的再生；而且，孔隙率与鼠骨髓干细胞和成纤维细胞的增殖和分布有关。

1.2.4尺度和结构　纳米纤维支架在尺度和结构上更接近细胞外基质，为细胞的黏附生长提供了更加良好的微环境。

1.3纳米生物纤维支架的合成

常见的纳米生物纤维支架的合成分为自组装法和电纺法。自组装纳米纤维支架是指生物大分子，通常是亲水性多肽在pH调节下，由非共价键如氢键和静电力等介导形成的具有纳米结构的水合物。目前，已经有学者制造出具有三维结构的自组装纳米支架，但有关基因修饰的自组装纳米支架的报道并不多。电纺法是合成纳米纤维支架的另一种方法，其原材料可以是无机物和天然有机材料或合成有机材料。各种材料形成的多聚物溶液通过高电压克服其表面张力，形成直径数百纳米的纤维，继而通过电纺方式形成纳米支架。电纺纳米支架具有良好的力学性能和细胞附着界面，通过改变纤维合成条件或表面修饰成为良好的生物活性物质的载体。

2　纳米纤维支架与基因结合的意义和方式

将基因与纤维支架结合，可以使基因局限于GTR部位，减少基因直接暴露于细胞外基质的时间，从而减少免疫攻击。将基因加载于生物支架，可以实现基因的控释，提高基因的转染率。这些已在一些研究中得到了证实。加载于纤维支架的基因具有缓释特性，这一特性可以降低病毒载体引起的急性炎症细胞因子的释放。纳米纤维组织工程支架可以分为二维膜和三维支架，两者在与DNA结合及释放上存在较为明显的差异。

3　基因修饰的电纺纳米纤维膜的合成与结合

3.1基因修饰的电纺纳米纤维膜的合成

基因修饰的电纺纳米纤维膜的合成主要分为两步。以Zhang等制作的PCL-聚乙烯亚胺（po-lyethylene　imine，PEI）-基因复合物为例。首先，将PCL与PEI以一定的比例溶于特定的溶液中，通过电纺技术形成PCL-PEI复合纳米纤维膜；将膜置于48孔板，加入含5μg基因的125mL的磷酸缓冲盐溶液培养1h，从而将基因固定于膜上。膜与基因的结合以特异及非特异性的结合力实现，其中PEI所带的正电荷与DNA所带的负电荷间的电荷力是主要作用力。此外，其他一些特异性的基因固定方法也被应用于研究之中。例如Kim等介绍了一种将病毒载体与基质金属蛋白酶结合固定于支架的方法；非纳米支架用生物素与抗生物素间的作用固定基因也有被提及，但尚未见其用于纳米支架。不同的材料与DNA间存在着不同的黏附性能，PCL-PEI与DNA间的黏附在30min达到50％的峰值，而单纯的PCL与DNA间的黏附只能达到15％的峰值。纳米纤维膜上DNA的释放机制尚无定论，可能缘于DNA与PEI形成PEI-DNA复合物，随着膜的降解，PEI-DNA逐步释放并实现基因的释放，其释放速率受PEI的释放速率影响。

3.2基因修饰的纳米纤维三维支架的合成与核壳结构

纳米纤维三维支架与DNA的结合主要以核壳结构实现。核壳是指使用同轴电纺技术合成的一种特殊纳米结构，其中某些材料构成的支架核结构与基因以一定的形式结合，另外一些可降解材料则形成壳结构并将前者包绕其中。这种结构可以起到保护基因、减少酶的作用，降低前者的免疫原性及细胞毒性，同时调节基因的释放。核结构可以加载的DNA可以是质粒、病毒或非病毒载体。基因的载入主要是在支架合成前，将适当的基因复合物加入核材料混合液中，使用同轴电纺技术形成目标产物。基因固定于支架的形式可分为两种：一是将含基因的微囊包埋于纳米纤维中，这种形式在非纳米结构的纤维支架中同样存在，但Yang等则认为，纳米组分相对于微米组分能加载更多的微囊；二是将基因通过静电力和范德华力等直接固定于纳米支架核结构中。

4　基因从纳米纤维支架中的释放

基因修饰的纳米纤维支架促进组织再生过程主要包含了三个阶段，即基因的持续缓慢释放、基因对目标细胞的转染和基因在目标细胞中表达。

4.1基因的黏附和释放

在二维纤维膜上，基因主要以电荷力固定于材料表面，其黏附主要取决于二维膜的成分。在同等条件下，PCL-PEI上负载的基因显著少于PCL-PEI-聚乙二醇（polyethylene　glycol，PEG）上的基因，但是在不同成分的纳米纤维支架中，基因的释放曲线则较相似；两种材料在6h内均有一个基因快速释放的过程，随后的3d则为持续的基因释放，释放率相近且同时达到峰值。

4.2三维纳米的控释性

由于基因修饰的三维纳米支架相对于二维支架膜具有更好的控释性，可为基因提供更好的防护，所以有关基因修饰的二维纳米膜的研究并不多，而三维纳米支架的研究则成为主流。三维纳米支架因结构上的不同，故较二维膜有着明显的优势。

4.2.1三维纳米支架为基因提供了更好的保护三维支架的核壳结构可以有效地减少基因在载入过程中的破坏。Yang等将质粒直接放入一定量的DNA酶液中，质粒在1h内被完全降解；将质粒加载于三维支架后置于相同的酶环境中，DNA的降解时间长达6h，从而证明将基因加载于三维纳米支架可以有效地延缓DNA的降解。这可能缘于起初基因以囊的形式存在于纤维中，未直接与细胞外基质接触，而随着壳结构的降解，基因逐渐暴露并被DNA酶识别降解。此外，三维纳米支架中往往会加入PEI等物质，与DNA形成稳定的复合物，对基因起到一定的保护作用。

4.2.2缓释和控释是三维纳米支架的另一特征在三维纳米支架基因的体外释放研究中，基因释放的过程主要分为三个阶段：初期的快速释放期，随后是逐渐减速的持续释放过程，最终达到释放的峰值。第一阶段时间较短，常为数小时或数十小时；而第二阶段的时间往往较长，可以持续2周至2个月。基因的持续释放因材料的不同而有明显的差异。Cao等闭制备了PCL、PCL-PEG20和PCL-PEG60三种材料的支架并在这些支架上加载了等量的基因，这些支架上的基因在49d内持续释放，累积释放量分别是总基因的3.01％、12.55％和26.30％，证明支架的不同材料组分会影响基因的释放过程。

4.2.3基因修饰的三维纳米支架具有良好的细胞转染率　研究显示，基因对在三维支架上培养的MSC相对于在二维膜上具有更高的转染效率和表达效率。在基因修饰的三维支架上，基因转染主要面临如下问题：1）基因的释放和基因克服细胞膜屏障；2）三维支架上基因的缓释相对于基因的一次性注入，具有更高的细胞转染率。不同的支架材料有着不同的细胞转染率。Yang等发现，相对于PELA-PEI-pDNA复合物，在支架中加入PEG可以明显地提高基因的转染效率。Saraf等则发现，只有PEG的相对分子质量和浓缩度对基因转染效率有显著的影响。这些对转染率的影响，很可能缘于影响了DNA的释放途径。此外，基因的表面修饰，如将质粒制备成非病毒载体，对基因转染同样有重要的影响。Park等发现，PEI可以通过与DNA形成复合物，从而降低DNA的降解，促进细胞对基因的摄取，逃避溶酶体作用。Yue等则通过不同比例的PEI和pDNA条件下的基因转染效率证实，只有当PEI与pDNA之比大于等于10，PEI与DNA间才会有比较高的转染效率。Liang等则证实，基因如果不经过修饰直接由支架释放，则缺乏转染作用。

5　小结

纳米纤维支架是良好的生物活性物质载体，可为细胞附着提供良好的平台，符合GTR技术的各项要求，具有广阔的临床应用前景；但是在目前，基因修饰的纳米纤维支架研究尚处于体外试验阶段，要达到临床应用目标尚需要克服如下问题。其一是纳米纤维支架材料的选择问题，许多材料的细胞毒性、组织相容性的研究尚不充分。其二是基因载体的选择问题，病毒载体具有良好的转染率，但有安全性疑虑；而非病毒载体制作简单，但转染率较低，能否产生明显的生物学作用尚不确定。何种基因载体具有更好的综合效果尚缺乏足够的研究。其三是基因转染的靶向性问题，即如何使合适的细胞结合合适的基因，发挥其合适的作用，从而更有效率地发挥基因修饰的纳米纤维支架的GTR作用。

（本文编辑　刘世平）