磷酸肌酸钠对大鼠肢体缺血再灌注心肌损伤的影响

[摘要] 目的 研究磷酸肌酸钠对肢体缺血再灌注后心肌损伤有无保护作用及其机制。 方法 选取SD大鼠24只，将其随机分为三组：①空白对照组（C组）；②肢体缺血再灌注组（LIR组）；③磷酸肌酸钠组（P组），每组8只。分别检测血清肌钙蛋白I（c-TnI）、磷酸肌酸激酶同工酶（CK-MB），心肌组织中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、钙调蛋白（CaM）的含量，并且观察各组心肌组织的病理变化。 结果 LIR组与C组相比，血清c-TnI、CK-MB及心肌组织中MDA、CaM的含量都显著增高，而SOD含量明显下降，心肌组织有明显的病理变化；P组与LIR组相比，SOD活性相对升高，c-TnI、CK-MB、MDA、CaM含量相对降低，病理变化有所改善。 结论 肢体缺血再灌注可诱发心肌组织的损伤；外源性磷酸肌酸钠可减少肢体缺血再灌注心肌组织内氧自由基的产生，维持细胞内钙平衡，起到保护心肌的作用。

[关键词] 磷酸肌酸钠；肢体缺血再灌注；心肌损伤；氧自由基

[中图分类号] R-33 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）01-0001-03

临床上的肢体创伤、断肢再植、手术使用止血带时间过长、血栓形成、挤压综合征等均可导致肢体缺血再灌注损伤。近年来对肢体缺血再灌注（limb ischemia reperfusion，LIR）的研究发现[1]，LIR不仅单纯导致肢体的损伤，还可诱发心、肺、脑、肝、肾等远隔器官的损伤，甚至可引发多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）。LIR导致心脏损伤的机制现在研究表明主要是通过氧自由基、中性粒细胞（PMNs）介导的[2]。如何改善和避免LIR导致的损伤已经引起了人们的关注。磷酸肌酸钠作为一种能量合剂，具有抗氧化、清除氧自由基、改善微循环等及维持细胞内钙平衡的作用。本次实验通过建立肢体缺血再灌注继发心脏损伤的模型，探讨外源性磷酸肌酸钠对其的保护作用及其机制，为临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料和分组

健康雄性SD大鼠24只，体重200～230 g，由潍坊医学院动物中心提供，随机分为三组：C组、LIR组、P组，每组8只。MDA、SOD、CaM试剂盒购于南京建成生物研究所。注射用磷酸肌酸钠购自北京利祥制药有限公司。

1.2 动物模型制备

大鼠术前12 h禁食，自由饮水。用10%水合氯醛腹腔注射（3 mL/kg）麻醉。用橡皮圈环扎大鼠双后肢根部，阻断大鼠双下肢血流，环扎后双下肢不能触及动漫波动趾掌苍白发凉。双下肢环扎4 h后，剪断橡皮圈，恢复血流灌注4 h，动脉搏动恢复，双下肢逐渐变红变暖，建模成功。P组于再灌注前5 min腹腔注射磷酸肌酸钠（150 mg/kg）；LIR组再灌注前注射同等剂量的生理盐水；而C组双下肢不环扎只注射同等剂量的生理盐水。

1.3 标本的采集及检测

再灌注4 h后，腹腔注射水合氯醛麻醉，开腹于下腔静脉取血3～5 mL，装于促凝管，放置1 h凝固后3 000 r/min离心15 min，取上清液即血清，装于EP管中冰箱-20℃保存；取血后迅速开胸，取出心脏。

1.4 观察指标

①检测血清中c-TnI、CK-MB的含量；②将心尖组织切下，生理盐水冲洗干净，置于10%甲醛溶液中固定，石蜡包埋，常规切片，HE染色。光镜下观察心肌的病理变化。③去心肌组织400 mg，制成10%心肌组织匀浆，检测心肌组织中MDA、SOD、CaM的含量，严格按照试剂盒说明书的操作步骤进行。

1.5 统计学处理

采用SPSS13.0统计学软件对数据进行处理，所有数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清c-TnI、CK-MB含量

与C组相比，LIR组和P组血清c-TnI、CK-MB含量均增高（P < 0.01）；与LIR组比较，P组血清c-TnI、CK-MB含量则下降（P < 0.05）。见表1。

2.2 各组心肌中MDA、SOD、CaM的变化

LIR组、P组分别与C组相比，MDA、CaM含量都升高，SOD活性降低（P < 0.05）；P组相较于LIR组，MDA、CaM含量降低，SOD活性增高（P < 0.05）。见表2。

表2 各组心肌中MDA、SOD、CaM含量的比较（x±s）

注：与C组比较，★P < 0.01，☆P < 0.05；与LIR组比较，○P < 0.05

2.3 心肌组织形态学变化

光镜下观察，C组可见大鼠心肌排列整齐，肌间隙未见炎性细胞浸润；LIR组可见部分心肌纤维断裂，肌间隙增宽，大量炎性细胞浸润，毛细血管充血、扩张，肌间隙内有红细胞漏出，心肌细胞肿胀，甚至可见心肌坏死；P组心肌的病理损伤有所改善，但未恢复正常。见封三图1～3。

3 讨论

缺血再灌注损伤是一个多因素参与、多机制损伤的过程，其中关键在于能量代谢障碍、钙离子超载、氧自由基生成、白细胞的激活等方面[3]。而由肢体缺血再灌注导致的远隔器官的损伤也越来越得到大家的重视。近年来研究[4-6]结果表明，LIR后心肌组织中MDA、髓过氧化物酶（MPO）、TNF-α、IL-10水平、Bax表达、凋亡指数（AI）明显升高，SOD活性降低，左心室功能降低，证明了LIR可引起心肌的氧化应激反应、白细胞聚集、细胞凋亡等各方面的损伤。

MDA和SOD这对指标反映体内的氧化-抗氧化系统，间接反映了氧自由基产生的情况。MDA是氧自由基引发的脂质过氧化反应的终末代谢产物，其含量反映了体内脂质过氧化程度，间接反映了组织内自由基的水平。SOD是清除超氧阴离子Oˉ2的专一歧化酶，其活性变化可反映体内抗氧化功能的情况，是一种内源性保护机制，避免氧自由基的储积。实验结果表明，LIR使心肌组织中MDA含量显著升高，SOD活性下降，说明肢体缺血再灌注后，氧在黄嘌呤氧化酶的作用下释放大量氧自由基，引发心肌组织的脂质过氧化损伤，破坏心肌细胞膜的完整性，致使细胞的功能代谢发生障碍。c-TnI、CK-MB是心肌损伤的常用指标，广泛应用于对心脏疾病的诊断中，特别是c-TnI具有诊断窗口宽，诊断阈值明确及检测快速等优点，成为了判断心肌损伤的金标准[7]。P组的情况有所改善，说明磷酸肌酸钠可起到清除自由基、抗氧化的作用。

钙调蛋白（CaM，也称钙调素），是一种细胞内最重要的钙受体蛋白，可参与调节生物体内多种Ca2+依赖的生理生化反应[8]。CaM通过与Ca2+特异性结合形成Ca2+-CaM复合物，调节Ca2+的跨膜转运和肌浆网对Ca2+的摄取和释放[9]。肢体缺血再灌注后导致心肌的氧化应激反应，使心肌细胞内Ca2+迅速增多，与CaM结合，使其活性升高，可直接激活由Ca2+-CaM调节的多种代谢酶，如一氧化氮合酶（NOS）、CaM依赖性蛋白激酶（CaMK）、磷酸二酯酶、腺苷酸环化酶（AC）等，这些酶均可引起心肌细胞的代谢障碍，进一步破坏细胞膜、线粒体等的功能，使细胞内Ca2+、组织内自由基进一步增多，形成心肌损伤的恶性循环。外源性磷酸肌酸钠能被机体组织迅速吸收，直接释放高能磷酸键，合成ATP，迅速补充机体能量，保护细胞结构、稳定细胞膜，增加缺氧组织对氧的利用，减轻缺氧组织的损伤[10]。本实验研究结果表明，LIR组大鼠心肌组织内CaM含量明显升高，而P组相对减少，说明给予外源性磷酸肌酸钠后，为心肌细胞提供ATP，稳定了细胞膜，减少了Ca2+细胞内流，改善了心肌细胞代谢障碍，减轻了心肌组织的病理损伤。

综上所述，LIR可导致机体内的自由基大量产生、白细胞大量激活“呼吸爆发”，诱发远隔器官心脏的损伤；再灌注前给予外源性磷酸肌酸钠，可改善LIR诱发的心肌损伤，可能的机制是磷酸肌酸钠可为心肌细胞提供能量，为心肌细胞膜上的Ca2+交换泵提供ATP，减少Ca2+内流，降低CaM的活性，维持细胞内Ca2+平衡，从而起到减少自由基生成、抗氧化、防止钙超载、改善微循环等药理作用。临床上对肢体缺血再灌注导致心肌损伤的程度及应用磷酸肌酸钠的意义还有待证实。

[参考文献]

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（收稿日期：2013-09-10）