基于直立碳纳米管大面积金粒子的DNA生物传感器用于早幼粒白血病/维甲酸受体α融合基因检测

公司），采用三电极体系：直立碳纳米管阵列电极（直径d=2 mm）为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl为参比电极。JEOL S4800 FESEM型场发射扫描电子显微镜（日本JEOL公司）。

羧基化的CdTe量子点（深圳市中鼎盛投资有限公司，编号QDWS1L54001，粒径约3.0 nm）；1（3二甲氨基丙基）3乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl，上海延长生化科技公司）； N羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐（NHSS，上海生工生物技术公司）；牛血清白蛋白（BSA，SigmaAldrich公司）。其它试剂为分析纯，实验用水为超纯水（MilliQ，美国Millipore公司）。缓冲溶液：0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.0）； 0.1 mol/L NaAcHAc缓冲液（pH 5.2）。所用DNA序列由上海生工生物技术公司合成，具体序列见表1。

2.2实验方法

2.2.1直立碳纳米管阵列（ACNTs）电极的制备摘要 [14]用化学气相沉积法合成ACNTs 摘要 [15]，再用磁共振法在其上溅射一层金粒子摘要 [14]，用10% HF将直立碳纳米管阵列从石英基底上剥离，制成ACNTs工作电极。

2.2.2CdTe量子点修饰的DNA探针（CdTessDNA）的制备在含2 OD检测ssDNA（探针2）的样品管中加入200 μL 3 mol/L 咪唑溶液，室温涡旋振荡30 min。再加入5 mL 0.1g/L CdTe量子点溶液和100 μL 0.1 mol/L的EDC溶液，继续搅拌12 h。14000 r/min离心30 min，黄色沉淀用PBS缓冲液充分洗涤，再分散到PBS缓冲液中，得CdTe量子点修饰的DNA探针（CdTessDNA）。

2.2.3探针1在ACNTs电极上的自组装固定在4°C条件下，将巯基修饰的捕获探针（探针1）通过自组装（组装时间12 h）修饰到ACNTs电极表面的金粒子上，用1% （w/w）BSA封闭非特异性作用位点，用PBS缓冲液清洗电极，得ACNTs/probe 1 电极。

2.2.4双杂交反应在37℃恒温箱中，将ACNTs/probe1电极和一定浓度的目标DNA溶液，在缓慢振荡下，杂交反应30 min，用PBS缓冲液冲洗电极。将该电极和CdTessDNA进行杂交反应30 min，用PBS缓冲液冲洗电极，得到ACNTs/probe1/target DNA/CdTessDNA电极。

2.2.5电化学检测用0.2 mL 0.1 mol/L HNO3溶液充分溶解电极表面的CdTe量子点，加入1.8 mL 0.1 mol/L NaAcHAc缓冲溶液（pH 5.2）配制成检测液。以镀汞膜的玻碳电极为检测电极，利用差分脉冲阳极溶出伏安法摘要 [16]测定Cd2+的峰电流。

3结果与讨论

3.1基于直立碳纳米管大面积金粒子构建DNA生物传感器的检测原理

通过在ACNTs电极面溅射了大面积金粒子，采用三明治模式，构建高灵敏的电化学DNA生物传感器，用于检测急性早幼粒细胞白血病PML/RARα 融合基因的DNA片段。检测原理如图1所示。首先在金粒子表面通过自组装固定巯基修饰的捕获探针，再将氨基修饰的探针2与羧基化的CdTe量子点通过酰胺缩合反

应制备成CdTe修饰的探针，然后与目标DNA杂交形成三明治结构。采用HNO3溶解捕获至电极表面的CdTe量子点，利用阳极溶出法检测Cd2+信号。直立碳纳米管大的比表面积以及在碳管表面溅射的大量的金粒子，大大增加DNA分子在电极上的固定量，结合阳极溶出法对Cd2+富集与溶出的放大作用，所制备的传感器表现出很高的灵敏度。

3.2ACNTs电极的SEM表征和循环伏安特性

图2是直立碳纳米管（长度约50 μm）的侧面（图2a）和顶端（图2b和2c，c为b黑框区域的放大图）的场发射扫描电镜（FESEM）图像。由图可以看出，直立碳纳米管排列致密且均匀有序，定向性好，顶端开口（图2b和2c），侧壁上包裹了大面积的金粒子（图2a和2c），相比于常规金电极具有更大的表面积，可以固定更多的生物分子。

Fig.3Cyclic voltammograms of bare Au electrode （a） and ACNTs electrode （b） in 0.1 mol/L H2SO4 at a scan rate of 100 mV/s但ACNTs电极的氧化还原峰电流与金电极相比明显增大。根据文献[17]方法，通过还原峰电流测得ACNTs电极中金粒子的有效面积为39.8 mm2，明显大于ACNTs电极的几何面积3.14 mm2，粗糙度系数（Rf）为12.7摘要 [18]。由此可见，在ACNT 表面溅射金粒子可增加电极的表面积，提高DNA分子在电极表面的固定量和直立碳纳米管电极的导电性。

3.3杂交反应时间的优化

对两次杂交反应的时间进行了优化。实验发现，当杂交时间在0～30 min之间，响应信号随着杂交时间延长而增大；当杂交时间超过30 min，响应信号增大的较慢，因此选择两次杂交时间均为30 min。

3.4DNA的测定

将两步杂交反应后捕获到电极表面的CdTe量子点先用硝酸溶解，然后利用差分脉冲阳极溶出法（DPASV）测定其电化学信号。结果表明，响应信号随着目标DNA浓度的增加而增大。图4是不同浓度的目标DNA对应的Cd2+的DPASV响应，插图为目标DNA的浓度对数值与相对应的Cd2+的DPASV响应电流的关系曲线。当目标DNA浓度在1.0×10

Symbolm@@ 12～1.0×10

Symbolm@@ 8mol/L范围内时，Cd2+的DPASV响应电流与目标DNA的浓度对数值之间呈线性关系，线性方程为ipa（μA） =1.626 + 0.132lgC（mol/L），相关系数R=0.996，检出限为4.0×10

Symbolm@@ 13 mol/L （3σ，n=11）。结果表明，构建的DNA传感器具有很高的灵敏度，并且高于文献报道的基于金电极和CdS纳米粒子检测DNA杂交的方法摘要 [14]及基于CdS纳米粒子和主客体识别技术的均相杂交的DNA生物传感器摘要 [16]。同一批内5支电极制备的传感器响应电流的 RSD=6.9%。显示出良好的重现性。

3.5方法的特异性图5是不同DNA序列存在下电极表面的Cd2+ 的DPASV响应。与空白样品相比，完全互补PML/RARα融合基因序列产生了非常明显的DPASV信号；而另外4个序列的DPASV信号很低，和空白样品的差别不大。上述结果表明，所构建的DNA传感器可以区分单碱基错配DNA序列、三碱基错配DNA序列、PML 基因片段（只有一半互补）、RARα基因片段（只有一半互补）和完全互补的PML/RARα基

结果表明， 由于直立碳纳米管的大的比表面积、碳管表面溅射的大量的金粒子，以及CdTe量子点作为杂交指示剂利用阳极溶出检测的放大用，构建的生物传感器具有灵敏度高、特异性好、制作简单等优点。

References

1Bennett J， Catovsky D， Daniel M， Flandrin G ， Galton D A G， Gralnick H R， Sultan C. Br. J. Haematol.， 1976， 33（4）： 451-458

2Han J Y ， Kim K E， Kim K H， Park J I， Kim J S. Leukemia Res.， 2007， 31（2）： 239-243

3Mokany E， Todd A V， Fuery C J， Applegate T L. Methods Mol. Med.， 2006， 125： 127-147

4ZHANG Qiang， LI YuYun， XU XiuCai， ZHAI ZhiMin. Chinese J. Clin. Lab. Sci.， 2010， 28（4）： 281-282

张 强， 李玉云， 徐修才， 翟志敏. 临床检验杂志， 2010， 28（4）： 281-282

5Sun W， Zhang Y Y， Hu A H， Lu Y X， Shi F， Lei B X， Sun Z F. Electroanalysis， 2013， 25（6）： 1417-1424

6CHENG GuiFang， HUANG CuiHua， ZHAO Jie， TAN XueLian， HE PinGang， FANG YuZhi. Chinese J. Anal. Chem.， 2009， 37（2）： 169-173

程圭芳， 黄翠华， 赵 洁， 谭雪莲， 何品刚， 方禹之. 分析化学， 2009， 37（2）： 169-173

7Yola M L， Eren T， Atar， N. Electrochim. Acta， 2014， 125（10）： 38-47

8Li Y， Deng J， Fang L C， Yu K K， Huang H， L L， Liang W B， Zheng J S. Biosen. Bioelectron.， 2015， 63（15）： 1-6

9XU Kai， YE ZunZhong， YING YiBin. Chinese J. Anal. Chem.， 2008， 36（8）： 1113-1116

许 凯， 叶尊忠， 应义斌. 分析化学， 2008， 36（8）： 1113-1116

10Jin L， Bower C， Zhou O. Appl. Phys. Lett.， 1998， 73（9）： 1197-1199

11Vigolo B， Pénicaud A， Coulon C， Sauder C， Pailler R， Journet C， Bernier P， Poulin P. Science， 2000， 290（5495）： 1331-1334

12Wang S G， Wang R， Sellin P J， Zhang Q. Biochem. Biophys. Res. Commun.， 2004， 325（4）： 1433-1437

13Yang J， Xu Y， He P G，Fang Y Z. Electroanalysis.， 2013， 25（10）： 2345-2353

14Yang L Z， Xu Y， Wang X H， Zhu J， Zhang R Y， He P G ， Fang Y Z. Anal. Chim. Acta， 2011， 689（1）： 39-46

15SONG HaiYan， LI YanNan， ZHAO Kun， YE XiaoYan， HE PinGang， SUN Zhuo， FANG YuZhi. Chem. J. Chinese Universities， 2007， 28（9）： 1622-1626

宋海燕， 李艳楠， 赵 琨， 叶晓燕， 何品刚， 孙 卓， 方禹之. 高等学校化学学报， 2007， 28（9）： 1622-1626

16Chen X， Wang Y， Zhou J， Yan W， Li X， Zhu J J. Anal. Chem.， 2008， 80（6）： 2133-2140

17AngersteinKozlowska H， Conway B E， Hamelin A， Stoicovicu L. J. Electroanal. Chem. Interf. Electrochem.， 1987， 228（12）： 429-453

18Fan H， Xing R， Wang X H， Xu Y， Wang Q J， He PG， Fang Y Z. Electroanalysis.， 2010， 22（15）： 1781-1786