酶法合成对羟基苯甘氨酸工艺研究

2022-05-01 08:45:02 | 浏览次数：

摘要：该文通过生物酶法合成中对酶反应的各项条件比色法的测定，结果表明，在温度40℃、pH值8.5、底物浓度4%、酶浓度80mg/mL条件下，酶活力最高，金属离子Co2+、Mn2+ 和Ni2+ 对酶活力有促进作用，从而使酶反应的转化率和产品的收率达到最大化，进而可以运用于其工业化的生产。

关键词：酶法合成；D-对羟基苯甘氨酸；茚三酮显色法；酶活力

中图分类号 TS213.2 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）03-04-0016-2

Abstract：Enzymatic is to obtain optical pure D-hydroxy phenyl glycine on important way. Based on the enzymatic synthesis of enzyme reaction in the conditions for the determination of colorimetric method，it is concluded that the enzyme reaction optimum temperature of 40 ℃，the optimum pH value of 8.5，the optimum substrate concentration was 4%，the optimal enzyme concentration was 80 mg/mL and metal ions can improve the enzyme reaction dynamic Co2+，Mn2+and Ni2+，etc. So that the enzyme reaction conversion and product yield to maximize，and can be applied to the industrialized production.

Key words：Enzymatic synthesis.；D - hydroxy phenyl glycine；Ninhydrin color；Enzymatic activity

D-對羟基苯甘氨酸，分子量为167.16，熔点为204℃，微溶于乙醇和水，易溶于酸或碱溶液生成盐[1-2]。国内大部分的生产企业基本也都采用乙醛酸工艺生产[3-4]。而这2种方法都为D-对羟基苯甘氨酸的化学生产法，这类方法不仅污染较大，生产过程中会产生氰化物，毒性高，而且原料昂贵、产量低、反应时间长，还会产生大量的废弃物，因而学者们开始研究用酶法生产D-对羟基苯甘氨酸[4-6]。

生物酶法生产又可分为2种，分别为酶拆分法和酶转化法，本实验主要研究酶转化法。酶转化法是指以DL-对羟基苯海因为底物，利用海因酶先将底物水解为N-氨甲酰基-D-对羟基苯甘氨酸，然后再用D-N-氨甲酰基氨基酸水解酶脱去氨甲酰基得到D-对羟基苯甘氨酸[7]的过程。

1 材料与方法

1.1 试剂 D-海因酶，N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶为上海源叶生物科技有限公司，DL-对羟基苯海因，氢氧化钠，盐酸，水合茚三酮，正丁醇为天津市天力化学试剂有限公司生产。

1.2 仪器与设备高压灭菌锅：江阴滨江，pH计：上海雷磁，紫外可见分光光度计：北分瑞利。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的制备见参考文献[8-9]。

1.3.2 底物浓度对酶反应的影响制备好4种不同浓度梯度的DL-对羟基苯海因溶液，分别为2%、4%、6%和8%，然后滴加NaOH溶液与HCl溶液，浓度都为6mol/L，使初始pH值调为9；在制备好的底物溶液中加入与底物相同质量的酶溶液，再在锥形瓶中通入氮气以置换出氧气，并用保鲜膜进行密封；然后在水浴恒温振荡器中振荡反应48h，温度为33℃，得到反应液，待测[10]。

1.3.3 pH对酶反应的影响称取0.38g的DL-对羟基苯海因粉末，溶解于90mL1/15M的磷酸盐缓冲液中（取5种不同的pH值，分别为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0），并加热进行溶解；溶解后取9mL溶液装于锥形瓶中，同时加入相同浓度的1.0mL酶溶液，再在锥形瓶中通入氮气以置换出氧气，并用保鲜膜进行密封；然后在水浴恒温振荡器中振荡反应30min，温度为33℃，后再加入浓度为6mol/L的HCl终止反应，得到反应液，待测。

1.3.4 温度对酶反应的影响按照测酶活力的方法，在4种不同温度条件下测定其酶活力，分别为30℃、33℃、35℃和40℃，在水浴恒温振荡器中振荡反应30min；后再加入浓度为6mol/L 的HCl溶液终止反应，得到反应液，待测。

1.3.5 酶浓度对酶反应的影响配制3种浓度分别为40mg/mL、60mg/mL和80mg/mL的酶溶液备用；然后制备底物浓度为4mg/mL的DL-对羟基苯海因溶液，并滴加NaOH溶液与HCl溶液，浓度都为6mol/L，使初始pH 值调为9；再取3个锥形瓶，每个锥形瓶中分别装入10mL溶液，同时在其中加入相同体积已配好的酶溶液，并在锥形瓶中通入氮气以置换出氧气，用保鲜膜进行密封；最后在水浴恒温振荡器中振荡反应，按24h，36h，48h等不同时间段，温度为33℃，并得到反应液，待测。

1.3.6 金属离子对酶反应的影响制备浓度为4mg/mL的DL-对羟基苯海因溶液，并滴加NaOH溶液与HCl溶液，浓度都为6mol/L，使初始pH值调为9；再取5个锥形瓶，每个锥形瓶中分别装入10mL溶液，同时在其中加入相同质量的酶溶液，再在其中分别滴加含Co2+、Mn2+、Ni2+、Hg2+和Cu2+的溶液，并在锥形瓶中通入氮气以置换出氧气，用保鲜膜进行密封；最后在水浴恒温振荡器中振荡反应48h，温度为33℃，得到反应液，待测。

2 结果与分析

2.1 底物浓度对产物浓度的影响从表1分析可得，酶浓度越大，生成相似浓度的产物所用时间越少，即加大酶浓度，酶反应速率加快。

2.2 pH值对酶活力的影响从表2中分析可得，当pH值为8.5时，酶反应的活力最高。

2.3 温度对酶活力的影响从表3中分析可得，当温度为40℃时，酶反应的活力最高。

2.4 金属离子对酶活力的影响从表4可知，当pH值和温度都适宜时，酶反应的活力大约0.320～0.340，所以通过比较可得知，Co2+、Mn2+和Ni2+对酶反应的活力有加强作用，而Hg2+和Cu2+对酶反应的活力有抑制作用。

3 结论

采用茚三酮显色法对不同酶反应条件下生成的D-对羟基苯甘氨酸进行测定，并通过酶活力公式的计算，得出了该酶反应的最适底物浓度为4%、最适pH值为8.5、最适温度为40℃以及可以起酶活力加强作用的金属离子为Co2+、Mn2+和Ni2+。

参考文献

[1]董妍玲，谭新国，潘学武，等.海因酶法制备D-对羟基苯甘氨酸的研究进展[J].氨基酸和生物资源，2009，31（3）：47-52.

[2]陈建波，徐毅.生物酶法制备D-对羟基苯甘氨酸的研究[J].生物学杂志，2007，24（5）：35-47.

[3]趙欣.双酶法合成D-HPG转化条件的研究及高产菌株的选育[D].沈阳：沈阳药科大学，2006.

[4]宋慧敏，屠春燕，欧阳平凯，等.高效液相色谱法测定D-对羟基苯甘氨酸[J].南京工业大学学报，2002，24（4）：17-20.