基因治疗的病毒载体系统

[摘要]基因治疗是向靶细胞或组织引入外源基因片段，通过纠正或补偿缺陷基因，关闭或抑制异常表达的基因，从而达到治疗目的的一种生物医学技术。病毒载体是一种可将遗传物质带入细胞的分子生物学工具，其原理是利用病毒具有传送其基因组进入其他细胞，进行感染。在基因治疗中，因组织的靶向性，特异性，转染表达等不同，选择使用不同的病毒载体，以下综述了逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、α-病毒载体以及痘病毒载体，并提出了病毒载体的发展方向和必要性。

[关键词]基因治疗；载体；病毒；感染；基因表达

[Abstract]Gene therapy is to cure the inherited or acquired diseases through delivering normal genes to targeted cells and replacing the unorderly genes. Viral vectors have different capabilities as gene delivery vehicles for vaccines and immunotherapeutics.The principle is that virus can deliver the gene to other cells by infection. The methods used so far were reviewed in viral systems including retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpessimplex virus, α-virus and vaccinia virus.Also, the development of virus vectors for gene therapy was reviewed in this paper.

[Key words]gene therapy; vector; virus; infection; gene expression

基因治疗是当代医学和生物学的一个新的研究领域，始于20世纪80年代。它主要是向靶细胞或组织中引入外源基因DNA或RNA片段，以纠正或补偿患者基因的缺陷，关闭或抑制异常表达的基因，从而达到治疗疾病的目的。1990年第一次把腺嘌呤脱氨酶（ADA）基因成功导入到人体内的T淋巴细胞中用来治疗ADA基因缺失病，由此标志着人类历史上基因治疗时代的开始。本文主要介绍基因治疗中常用的6种病毒载体的生物学特性。目前，基因治疗已从遗传病扩展到非遗传病领域，例如：传染病，肿瘤，神经系统疾病，免疫缺陷病等。

1逆转录病毒载体

逆转录病毒（retrovirus.RV）为单链RNA病毒，是病毒载体中应用最早，研究成熟，目前被广泛应用的载体。逆转录病毒是基因组为8.5kb的小RNA，进入细胞后，病毒RNA即逆转录为双链DNA，并整合到细胞基因组中。将水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）整合于逆转录病毒包膜中能加速各种宿主细胞对其进行膜融合和内吞，具有广泛的宿主范围和更高的转染效率，可高效的转染静止细胞，且能抵抗血清补体灭活的作用[1]。为了提高逆转录病毒感染靶细胞的特异性，降低其潜在的危险性，可以在原来的病毒Env蛋白上接上一段具有特异靶向的多肽，目前应用较多的是单链可变区抗体（acFV）；还可通过插入组织特异启动子实现靶向表达。第三代包装细胞系Ψ-crip和Ψ-cre使载体与包装细胞间至少需要发生四次同源重组才可能产生有复制能力的逆转录病毒，提高了逆转录病毒载体的安全性。逆转录病毒载体有感染效率高、外源基因整合到细胞基因组中、可长期表达而不产生任何有免疫原性的病毒蛋白等优点。但目前，基因转导所用的逆转录病毒载体为野生型逆转录病毒的改构形式，保留感染靶细胞能力而去除复制能力，仍具有一定危险性。

慢病毒（Lentivirus）也属于逆转录病毒家族，是一类很有前途的基因转移载体。它既可以感染分裂细胞又可感染非分裂细胞。该病毒载体能整合入靶细胞基因组、不需要反复转导细胞。最为人们熟知的慢病毒是人免疫缺陷病毒（HIV），复制缺陷型HIV可被用于基因转移。HIV具有简单逆转录病毒的3个基因（gap、pol和env）。此外还有5种辅助蛋白基因（tet、rev、vpr、nef和vif）。以HIV-1为例，其进入细胞需要结合两种细胞表面受体。这种趋化因子受体可能是CCKR4（主要是T细胞表达）或CCKR5（主要是巨噬细胞表达）。利用HIV-1的这一特性可使基因转移具有特殊的靶向[2]。虽然使用缺陷性病毒时靶细胞不表达病毒蛋白，人们对其安全性还存有一定疑虑。所以，科学家们正尝试在不影响病毒功能的前提下尽量删除病毒序列以建立更加安全的慢病毒载体。

2腺病毒载体

腺病毒（Adenovirus.AV）为线性双链DNA无包膜的裸露DNA病毒，最大可携带7.5kb左右的外源基因。它的宿主范围广，均可感染分裂和非分裂细胞。与逆转录病毒家族载体不同，腺病毒基因组不能整合到宿主细胞基因组中，而是以附加体的形式存在，不随宿主细胞分裂而复制，治疗中有时需要反复转导。这一特性对于免疫基因治疗来说是非常有利的，用腺病毒裁体将不会导致象能整合的载体那样使用后出现对免疫系统缠绵持久的刺激。

腺病毒转录单位密集而复杂，重组困难，仅限于特定的区域，一般是在E1、E2A、E3和E4。第一代腺病毒载体通常以转移基因取代E1A和E1B，但是这种载体有明显的缺陷如包装能力较低、细胞毒性较强、易引发免疫反应。近年来，在增大载体容量、降低细胞毒性、减弱宿主兔疫反应等方面的研究有了很大进展，切除了E1和E3的第二代载体，延长了转移基因在体内的表达时间并降低了细胞毒效应[3]。

研究表明，E1区替代型复制缺陷型腺病毒载体Ad5具有感染及表达效率高、遗传毒性低、制备方法相对简单、可获得高滴度（1012pfu/ml）纯化载体等优点。由于重组腺病毒载体不整合入宿主细胞染色体、其DNA以附加体形式存在于染色体以外，表达时间相对短暂，因此是IL-2在肿瘤基因治疗中的适宜载体系统。重组Ad5腺病毒直接注射进入小鼠H22肝癌组织，能有效地进行转染与原位表达，具有明显的抗肿瘤作用。有人观察了携带人野生型P53、GM-CSF和B7-1基因的重组腺病毒载体（BB-102）转染BEL-7402、HLE及HuH-7肝癌细胞后P53基因的表达等情况，发现P53基因能在转染了BB-102的肝癌细胞中高效表达；肝癌细胞生长明显受到抑制；转染BB-102还能诱导肝癌细胞的凋亡。BB-102可能通过其介导P53基因的表达抑制肝癌细胞的增殖，在肿瘤的基因治疗中，选择性复制型腺病毒载体的治疗作用明显高于复制缺陷型腺病毒载体。

虽然重组腺病毒载体应用日益广泛，但有几个主要缺陷仍需改进，腺病毒载体介导的基因表达通常都是短期的；在体内引发强的免疫和炎症反应；单次大剂量应用，会激发抗病毒的中和抗体产生，降低系统应用的效率；特异性较低。若切除了腺病毒的E1、E2和E4基因，能避免其在宿主细胞中表达免疫原性病毒蛋白。Belousova等[4]报道，通过在衣壳上嵌合CD40配体，可以使腺病毒载体高效感染CD40阳性的树突状细胞和肿瘤细胞，这一特点可用于遗传性免疫疾病和肿瘤的基因治疗。Kreppel等[5]构建的高容量腺病毒载体（HC-Ad）可以在大鼠视网膜色素上皮细胞中持续表达6个月，而有人利用神经元特异的强启动子，使重组腺病毒载体在脑海马会中的表达时间可长达9个月。总之，腺病毒由于其本身的生物学特点，有其独特的优势，加强对腺病毒载体的基础研究，一定会促进这一基因转移载体的发展和完善。

3腺相关病毒载体

腺相关病毒（Adeno-associatedVirus.AAV）又称副腺病毒，是一类属微小病毒科。AAV是一种缺陷病毒，不能进行独立复制，只有在辅助病毒，如腺病毒、单纯疮疹病毒、痘苗病毒存在的情况下，才能进行最佳复制，产生新的病毒颗粒，否则只能进行潜伏感染。AAV载体具有安全，宿主范围广，可以长期表达转基因产物的特点，使它在基因治疗领域得到广泛的应用。目前已发现的AAV有8种血清型，各种血清型AAV载体主要区别是衣壳蛋白不同，因此对不同的组织和细胞的转染效率存在差异。目前应用最多的AAV载体是血清型2，即AAV2，其基因组是长4680bp的单链线状DNA，两侧为两个长145bp的回文序列，称反向末端重复序列（invertedterminalrepeat，ITR），呈T形发夹样结构。ITR为病毒DNA复制，包装，“拯救”所必需的唯一顺式作用元件。AAV2进入细胞的过程是由基础受体（硫酸肝素蛋白多糖受体）和辅助受体包括1型成纤维细胞生长因子受体（FGFR21）和整合素αⅤβ5介导产生，其对多种组织细胞（如表面具有硫酸肝素蛋白多糖受体的肌肉、视网膜、肝脏、神经元细胞等）具有较好的转染效率。AAV作为基因治疗载体的优势主要有：（1）AAV是一种人源性的病毒，对人体无致病性，免疫反应轻微；（2）可定点整合至人的19号染色体，并能较稳定的存在，从而避免了其它病毒随机整合可能引起的抑癌基因失活和原癌基因激活的危险；（3）AAV介导的基因转移系统可使外源基因持续稳定表达，并可受到周围基因的调控；（4）AAV的宿主范围很广，包括分裂期和非分裂期的多种细胞；（5）AAV转移系统具有较好的热稳定性和抗酸碱（Ph3.0~9.0）性以及抗有机溶剂处理的特点，便于储存[6]。如Gao[7]等用含有AAV的rep/cap基因盒的质粒感染A549细胞获得K209细胞，代替293细胞，使细胞内rep/cap基因的表达扩增1000倍，增加了rAAV的产量。对不同的细胞，AAV载体的转染效率存在差异。Halbert等[8]报道，AAV-6载体对肺气道上皮细胞的转染率显著大于AAV-2载体，最高可达80%。用rAAV进行基因治疗若有轻度免疫反应，将影响转染效率。人群中约有50%～96%的人血清中带有抗AAV-2的抗体，其中有18%～75%为中性抗体，这些抗体的存在给rAAV的成功转导增加一定的难度。Bartlett等[9]对AAV表面进行化学修饰后，成功地转染了人巨核细胞系。由于存在利用效率低的问题，目前科研工作者进行了大量关于增强AAV基因载体效应的研究，AAV载体在多种组织都进行了成功的转染，如肝、脑、心肌、骨路肌、视网膜和气道上皮等组织，未发现对机体有致病性。

4单纯疱疹病毒载体

单纯疱疹病毒（herpessimplexvirus），（HSV）为双链有包膜的病毒，可感染分裂和非分裂细胞，作为基因治疗载体具有以下优点：（1）容纳外源基因的长度达40～50kb，是目前容量最大的病毒载体；（2）具嗜神经性，可在神经元中建立终生潜伏性感染，非常适用于神经系统疾病如帕金森氏病等；（3）滴度高；（4）可感染分裂期和非分裂期细胞。由于呈潜伏性感染，HSV载体非常适用于需要基因长时间表达的基因治疗，但在介导肿瘤基因治疗等要求基因短暂高水平表达的基因转移是不合适的。此外，HSV的细胞毒性有待进一步研究改善。早期基因（ICP4，ICP22，ICP27）的去除可明显降低HSV载体的毒性，避免引发脑炎的危险[10]。

目前研究较多的是HSV-1载体，主要用于慢性神经系统疾病、恶性神经胶质瘤、骨骼肌细胞及干细胞的基因转移。HSV1716是一个被改造过的异型HSV载体，能长期存在于神经胶质瘤细胞，而具有潜在的杀瘤效应[11]。Goss等[12]用复制缺陷的HSV载体表达神经生长因子以治疗糖尿病所致的神经病变，结果显示能阻止病变的进程。研究还表明干细胞对HSV易感，利用去除早期基因的HSV载体转导猴CD34+细胞，结果显示报告基因表达时间超过3周，说明HSV载体适用于干细胞的基因转移[13]。

5α-病毒载体

α-病毒（α-virus）属于披膜病毒科，宿主范围广泛，可以在哺乳动物和昆虫体内的不同细胞中复制，其病毒感染吸附依赖于敏感细胞表面的受体。其基因组RNA（49SRNA）一方面可以作为mRNA翻译合成非结构蛋白，另一方面又可以作为复制的模板合成负链RNA；反过来负链RNA又是新的病毒基因组RNA和26S亚基因组RNA合成的模板。α-病毒的多个成员已经被作为表达载体，并被引入基因治疗领域，其中最常用的是森林病毒（SemlikiforestVirus，SFV），Sindbin病毒（SindbinVirus，SIV）和委内瑞拉脑炎病毒（Venezuelanequineencephalitisvirus，VEEV）。除了原型病毒之外，其重组形式的病毒也相继出现。α-病毒已经发展成3种不同类型的载体：（1）复制缺陷型载体：通过将26S亚基因组MA和mPsRNA分割开来，将它们以cDNA的形式分别构成两个质粒（辅助质粒和表达质粒）。在mPscDNA下游插入外源基因，从而实现外源基因同mPs基因同转录和同复制。（2）复制型载体：在全长基因组之外还含有第2个亚基因组启动子，感染细胞后会引起病毒的复制。（3）分层DNA载体（IayeredDNA-vector）：不含结构蛋白基因，但在复制子cDNA上游引入Ⅱ型RNA聚合酶盒以启动复制子cDNA的转录，然后复制子才能发挥自己的作用，带动外源基因的表达。目前α-病毒在肿瘤治疗得到广泛应用，α-病毒能感染很多不同的肿瘤细胞系，重组病毒在感染的细胞中可以诱导明显的细胞凋亡[14]。同其他病毒载体相比，α-病毒是这个领域的一个新成员。具有比其它病毒制备方便、安全性高的优点[15]。当然在应用上它也不可避免的存在许多不足，如何提高它的利用率也是目前研究的一大热点。

6痘病毒载体

痘病毒（VacciniaVirus.VV）是双链DNA病毒，可感染分裂和未分裂细胞。它的基因组可承载25kb的转基因序列。痘病毒作为重组疫苗已获得巨大成功，临床前研究中，它又成功地实现了体内抗癌的细胞因子基因传递。单一痘病毒载体同时传递IL-2和IL-12并与肿瘤抗原合用，抗肿瘤效果和存活率都显著提高。疫苗病毒载体使用历史长、毒性小、外源DNA装载量大，是极好的基因传递载体。

7结语

目前而言，病毒载体系统虽然在基因治疗中占有绝对优势，作用不可替代，但仍然存在着一系列潜在问题：可能因随机插入而引起基因失活、重组；癌基因激活；野生型病毒生成；外源基因的装载能力不大，特异性和靶向性不强；有的甚至对机体有免疫原性等。随着研究的深入，病毒载体不断得以完善改进，更多安全、高效的新型病毒载体将源源不绝出现，使基因治疗这一全新的疾病治疗手段在很大程度上改变人类疾病治疗的历史进程，治愈人类目前难以治愈的疾病。

8展望

基因治疗病毒载体的研究已取得了较大进展，数个病毒载体可实现体内转基因的长时间表达，但病毒载体的安全性问题还有待进一步的研究解决，安全性和靶向性一直是人们研究的热点。研究表明通过使用组织特异性启动子或多聚物和脂质体的修饰，可提高基因转移的靶向性，且多聚物和脂质体的修饰还可减轻免疫反应，有利于载体的重复应用。载体中去除不必要的病毒基因，可明显减轻细胞毒性和免疫原性，还可避免产生可复制的病毒颗粒和人体感染病毒的危险。自我灭活或自我破坏病毒载体的构建也能提高病毒载体的安全性。总之，随着基础医学和分子病毒学的发展，人们对病毒载体的进一步改造完善，将使其在基因治疗中继续发挥着重要的作用。

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