慢病毒研究进展及其在肝病治疗中的应用

【摘 要】肝脏是人体维持生命活动的重要器官。肝炎、肝纤维化等疾病严重危害人体健康。目前多种肝病缺乏彻底治愈的特效药物，治疗难度较大。随着生物技术的发展，基因治疗已经成为疾病治疗的新焦点。慢病毒载体具有多种优点，广泛应用于基因治疗。本文就慢病毒载体的生物学特征以及在肝病治疗中的应用等方面作一简介。

【关键词】肝病；慢病毒

【中图分类号】R346 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）06-0084-02

肝脏是维持生命活动的一个必不可少的重要器官，是人体内最大的消化腺，体内物质能量代谢的中心站。常见的肝病有肝炎、肝脓肿、肝硬化、原发性肝癌等。肝炎、肝纤维化和肝癌严重威胁人类健康，是常见肝病发展的“三部曲”。中国是名副其实的“肝病大国”，治疗肝病三种原则分别是抗病毒，提高免疫力，恢复肝功能。多种肝病治疗的难度较大，诊疗过程漫长，目前尚无彻底的一次性治愈的特效药物问世。

随着生物技术的发展以及对疾病分子机制认识的加深，基因治疗已成为治疗肿瘤及多种疾病的新焦点[1]。基因治疗是向靶细胞中引入外源DNA 或RNA 片段，以补偿基因缺陷或抑制异常表达的基因从而达到治疗的目的。

理想的基因载体应既缺乏自身复制能力，安全无害，又具有稳定的靶向性。基因治疗的载体系统可分为病毒性载体和非病毒性载体两类。目前常用的病毒载体包括逆腺相关病毒载体、腺病毒载体、疱疹病毒载体、转录病毒载体、痘苗病毒载体等[2]。相比其他病毒载体，慢病毒载体不但可以感染非分裂期细胞，还具有免疫反应小、容纳外源性目的基因片段大等优点，在基因治疗中具有广泛的应用前景。本文将就慢病毒载体的生物学特征、研究进展以及在肝病治疗中的应用等方面进行总结。

1 慢病毒载体转导非分裂期细胞的分子机制

3 种分子元件决定了慢病毒载体转导非分裂期细胞的能力：MAN、IN 和vpr。这3 类蛋白利用细胞核的输入机制，靶向作用于细胞核的前整合复合物（ PIC）。细胞核的输入系统包括： 胞质蛋白、importin2a 、importin2b 及核孔蛋白。importin2a 含有一个细胞定位序列（NLS） 的结合位点，当含有NLS的蛋白与importin2a 结合在一起，发生构象变化，与importin2b 相互作用，然后importin2b 通过与核孔蛋白结合，靶向作用于核孔复合物。实际构建时，vpr 可以完全敲除而不影响慢病毒载体感染非分裂期细胞的能力。

慢病毒载体不仅可以用于基因过表达，也可用于基因敲除。

最早有关慢病毒介导RNA干扰的报道发表于2003年。此后的研究证明，慢病毒介导的RNA干扰具有稳定、高效、特异性强的特点；能在哺乳动物各类细胞中实现稳定的RNA干扰[3]。该技术在疾病的基因治疗上具有良好的前景。

2 慢病毒载体的发展

慢病毒载体是慢病毒经过改造而成，改造的目的主要是增加外源基因的表达效率以及提高生物安全性。各种慢病毒载体的结构和作用机制基本相同。

慢病毒载体系统主要由包装部分和载体部分组成。包装成分提供生产病毒颗粒所必需的蛋白质；载体成分则包括了将在宿主细胞内表达的目的基因。将包装成分和载体成分共转染细胞，即可从细胞上清液中收获携带目的基因、具有感染能力、无复制能力慢病毒载体颗粒。该病毒颗粒既避免了细胞毒性，又保留了高效感染特性。

2.1 第一代慢病毒载体

第一代载体系统由包装质粒、包膜质粒及载体质粒3种质粒组成。载体质粒携带了全部5"端非翻译区域和5"端LTR，还带3"端LTR以及rev应答元件。其瞬时表达盒采用巨细胞病毒（CMV） 启动子及增强子件。包装质粒由HIV21前病毒基因组简单修改得到，5"端LTR被异源病毒启动子/ 增强子元件取代。为防止辅助质粒的RNA衣壳化，其5"端主要剪接供体位点（splice donor site）和gag编码序列起始端之间的包装信号区（ E/ Ψregion）被删除，下游的启动子由外源多聚腺苷酸信号（poly A）取代。 rev虽仍然保留，但被点突变打断env编码序列。辅助结构能表达包括tat及rev（env除外）的所有病毒蛋白。env 由单独的包膜质粒携带并在病毒生产过程中共转染后表达。

该系统引入了VSV2G基因表达包膜结构，这样做既使HIV 载体感染宿主的范围扩大到几乎所有组织来源的细胞，又进一步降低了HIV21载体恢复成野生型病毒的可能，同时，这样的改进使HIV载体颗粒具有高度稳定性，能够通过超速离心而浓缩达到高滴度。第一代慢病毒系统是HIV载体系统走向应用迈出的一大步。

2.2 第二代慢病毒载体

第一代载体产生RCR的几率极小，仍然不能排除产生的可能性。1997年，有研究者等将包装质粒上的vpu 、vif 、vpr和nef 基因敲除，从而得到第二代慢病毒载体，其他方面与第一代载体系统相同。研究发现即使全部4个调节基因都被敲除，病毒颗粒的产量也不会受到影响，这种载体仍然具有体外感染非分裂期细胞、体内感染分化成熟大鼠神经元的能力，但是现在尚不确定这种载体能否转染全部种类细胞。由于敲除的调节基因与野生型HIV21 病毒的毒力以及生活周期密切相关，这些载体即使发生多位点重组形成RCR，亲代病毒仍不具有致病性。

2.3 第三代慢病毒载体

慢病毒系统的最大问题在于可能产生复制型病毒。当质粒DNA转染进入包装细胞，载体质粒以及辅助质粒的RNA包装入同一病毒颗粒时，将有可能发生重组。减少这种可能性的方法之一就是减少载体质粒与辅助质粒的同源性。另一个方法便是将gag/ pol 和rev编码序列隔离，分散在不同的质粒上。这样的包装系统需要四种质粒来代替原有的三质粒包装系统。质粒一携带了gag/ pol 编码序列及RRE ；质粒二包含了编码rev的序列；质粒三是载体质粒；质粒四表达env。采用四质粒代替三质粒系统、除去tat，减少了产生复制型病毒的可能性，增加了载体系统的安全性。

3 慢病毒在肝病治疗中的应用

3.1 HCV core的重组慢病毒的构建

丙型肝炎病毒感染大部分转变为持续感染，继而发展为肝硬化和肝细胞癌。HCV复制周期中没有DNA阶段，是一种正链RNA病毒。许多研究表明HCV的核心蛋白具有致癌潜能，但分子病毒学上缺乏HCV致癌的理论根据。HCV的core基因位于342～914nt间，长573nt，编码由191个氨基酸组成的C蛋白。HCV核心蛋白是组成HCV核壳体的基本单位，它同时又是一种多功能蛋白。有实验证实核心蛋白有促进肝细胞增殖的作用；在对HCV转基因动物的研究中发现，转基因鼠的HCV核心蛋白的表达可导致肝脂变和HCC的发生；HCV core可以在大鼠肝中持续表达，感染后的实验组大鼠部分细胞有恶性倾向。

研究HCV核心蛋白对肝脏干细胞的转分化作用，对于研究肝纤维化、肝肿瘤发生的机制具有重要意义。研究者使用第三代慢病毒载体系统，通过分子克隆体外重组技术制备了HCV core的重组慢病毒并成功表达，为下一步研究丙肝病毒致癌机制奠定了基础[4]。

3.2 重组慢病毒在Hep3B细胞中的应用

靶基因的选择是基因治疗的关键点。胰岛素样生长因子1受体（insu—lin like growth factor 1 receptor，IGFlR）是胰岛素样生长因子l（insulin like growth factor I，IGFl）发挥生物学效应的节点，P53是已知重要的抑癌基因，其通过调控受体、配体、结合蛋白的表达来控制该信号系统。

有研究通过表达IGFlR的小干扰RNA片段和wtP53的慢病毒，对肝癌Hep3B细胞进行体外研究。结果发现，构建的重组慢病毒能明显抑制体外Hep3B细胞的增值，促进细胞凋亡，并且具有较高的专一性，有望在肝癌基因治疗中提高特异性、安全性以及降低毒副作用等方面提供新思路。

3.3 MATU基因功能研究

MATU含有两个亚基其Ot和B分别MAT2A和2B基因所编码。胚胎时期MATlA低表达、MAT2A高表达，随着人的发育，MATlA在正常肝脏的表达逐渐增加，MAT2A的表达逐渐下降。而肝硬化以及肝癌的形成过程中MATlA向MAT2A转变，同时出现细胞内SAMe水平持续下降。MAT2B在正常肝细胞中没有表达，正常肝细胞向肝硬化以及肝癌发展过程中，MAT2B伴随着MAT2A表达增加而升高。

通过将3种慢病毒载体分别与肝癌细胞作用后观察细胞生长和凋亡，发现两者被同时抑制以后肝癌的生长抑制以及凋亡都更加明显，肝癌细胞内SAMe水平也出现上升[5]。由于无论是通过LV—siMAT2A降低SAMe水平还是通过LV—siMAT2B和LV.siMAT2A/2B提高SAMe水平，肝癌细胞的生长均受到抑制、细胞凋亡都增加，说明MAT2A和MAT2B对肝癌细胞增殖和凋亡的影响并非完全是通过改变细胞内SAMe水平来调节，尚存在其他途径。虽然MAT2A和MAT2B抑制肿瘤的机制不完全清楚，但本研究为肝癌治疗提供了新的靶点。

3.4 hTERT-L102细胞的构建

治疗急性肝功能衰竭病情惟一有效的措施是肝移植。正常人肝细胞是较为理想的细胞源。然而原代人肝细胞来源受限，功能维持时间短，体外培养缓慢，限制了其应用。因此构建理想的肝细胞系成为当前研究的重点。人端粒酶主要由端粒酶相关蛋白、端粒酶RNA及具有反转录酶活性的人端粒酶逆转录酶（hu—man telomerase transcriptase submit，hTERT）三部分构成。许多研究表明外源性hTERT基因的表达可以重建细胞中端粒酶的活性，进而延长细胞体外培养寿命，甚至发展为永生化。

有研究采用慢病毒载体作为基因转移载体，导人hTERT基因至1332肝细胞，构建hTERT—L02肝细胞，发现其在体外培养条件下基本维持肝细胞原有形态，并且具有增殖能力强，存活期长，转染肝细胞同样表达和分泌ALB，为肝细胞移植建立了新的实验基础，有望为临床提供安全可靠的肝细胞源，为建立永生化肝细胞系奠定研究基础。

4 小结

肝脏是人体内最大的消化腺，常见的肝病有肝炎、肝硬化、原发性肝癌等。多种肝病诊疗过程漫长，治疗难度较大。基因治疗已成为治疗感染性疾病以及肿瘤的新焦点。

本文总结了慢病毒载体的分子机制及其研究进展，着重介绍了慢病毒载体在肝病治疗中的应用，为研究丙肝病毒致癌机制奠定了基础，为肝癌的治疗提供了新的思路及靶点，同时也为建立永生化肝细胞系奠定研究基础，推进了肝病治疗的发展。

参考文献：

[1] 罗望. 慢病毒———基因转移的潜在新载体. 江苏药学与临床研究，2006 ，14 （6）

[2] 陈波斌. 慢病毒载体用于人类疾病基因治疗研究的进展. 国外医学输血及血液学分册，2002 ，25（6）；

[3] 杨馨. 慢病毒载体介导的RNA干扰. 细胞生物学杂志Chinese Journal of Cell Biology 2006，28

[4] 马列婷. 表达HCV core-Ant的重组慢病毒的构建. 西安交通大学学报（医学版） 2009 （04）

[5] 汪群. 慢病毒介导MAT2A及2B双重小干扰RNA对肝癌的抑制作用. 中华实验外科杂志2009，26（2）