磁性固定化酶的制备

2022-05-13 18:05:03 | 浏览次数：

【中图分类号】R91 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2014）02-0022-01

从60年代起，固定化酶的研究迅速发展，综述和专著大量涌现，人们不断地探索新的固定化材料和方法。酶的固定化（Immobilization of enzymes）是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有的催化反应，并可回收及重复利用的一类技术[1]。固定化之后酶的构象改变，可以提高酶的活性，也可以对其选择性进行调控。

固定化酶是近十余年发展起来的酶应用技术，不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃[2]，得到迅速发展和广泛的应用，如酶传感器和DNA的纯化等[3]。而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求，具有诱人的应用前景。而对于Fe3O4磁性固定化酶而言，Fe3O4具有较高的机械强度和催化活性，且具有磁性，容易分离，在催化分解有机污染物领域具有潜在的应用前景，对对硝基甲苯具有催化降解活性，可为有机污染治理提供新的材料与方法[4]。

国内酶固定化载体的研究取得了很大的进展，载体材料研究范围从传统的以聚合物材料为主发展到聚合物材料和无机材料共同发展的局面；聚合物载体材料的研究朝着功能化和精细化的方向发展；固定化酶朝着高活力保持率、长使用寿命、易于分离和可再生等方向发展；固定化所采用的载体会直接影响固定化酶的性质。用于酶固定化的载体种类很多，包括纤维素及其衍生物、壳聚糖及其衍生物、凝胶材料、有机合成聚合物等。近些年来，磁性物质作为一种绿色载体正逐渐成为研究的重点，它具有以下优点：有磁性，可方便简单地进行分离和磁性导向；具有很好的生物相容性；表面含有大量功能团；分散性好；机械强度高，磁响应强；不易溶胀，不易受微生物侵蚀，使用寿命长；传质阻力小，热稳定性好等。但是天然磁性物质成本高，难以满足酶工程领域的大规模应用要求。如果将人工合成的磁性介质与酶偶联，就能使酶也具备相应的磁性，并利用磁响应实现生物分离等操作。磁性粒子便是一种使用较为广泛的人工合成磁性物质。它是指粒径极小的具有铁磁性或亚铁磁性质的颗粒，通常为纳米级[5]。

固定化酶的研究始于1910年，正式研究于20世纪60年代，70年代已在全世界普遍开展。固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。物理方法包括物理吸附法、包埋法等。物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应，整体结构保持不变，酶的催化活性得到很好保留。但是这种固定化酶结合性差，在受到离子强度、PH值变化影响后会从载体上游离下来。化学法包括离子结合法、共价结合法和交联法等[6]。是将酶通过化学键合连接到天然的或合成的高分子载体上，使用偶联剂通过酶表面的活性基团将酶偶联起来，而形成结合更牢固的固定化酶。

与游离酶相比，固定化酶在保持其高效专一及酶催化反应条件温和的特性的同时，又克服了游离酶的不足之处，呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。而对于磁性固定化酶来说，它除了具备固定化酶稳定性好、可以多次使用等优点外，还具备酶与载体结合牢固、不会因底物浓度高或因有盐离子存在而轻易脱落、载体对蛋白质的固载量大、具有超顺磁性（即在有磁场作用时才表现出磁性[7]。铁磁性物质的颗粒小于临界尺寸时，在一个较强的外磁场存在下，磁性微粒有较好的磁响应性，可以从悬浮介质中分离出来，当撤去磁场后磁性微粒无磁性记忆，又会很快均匀地分散在介质中，这种性质就是超顺磁性。例如：无外磁场时，Fe3O4的临界尺寸为25.0nm）、在外磁场存在下极易将酶从反应体系中分离出来等特性[8]。

目前，固定化酶在国内外都得到广泛的重视和应用。虞和慈、刘光荣等人，用戊二醛做交联剂将酶和明胶载体进行交联。经交联后，不仅酶和明胶牢固地结合，且明胶本身失去了水溶性，从而得到理想的固定化。采用0.18～0.32mm细度的明胶，按明胶：酶液1：0.5（w/v）吸附后，以适量的25%戊二醛交联30分钟后即可得到分散性良好的微粒明胶固定化酶。采用此种固定化酶，裂解10%青霉素，6-APA收率可达84%以上。这种固定化酶在缓冲液中低温存放一年后，活力仍保留90%以上，在柱和搅拌罐两种反应器中，酶的半寿期分别为730小时和248小时[9]。崔娟研究了Lipase QL的固定化，选择载体涂布法为酶固定化方法，硅藻上为固定化载体，得到的固定化酶具有较高的转酯活力，为含相同蛋白量游离酶转酯活力的14.3倍，酶的回收率达到89%[10]。

鉴于固定化酶的稳定性仍然有待提高，2007年浙江大学的一项科研成果又进一步完善了这个方面。高稳定性固定化酶的制备方法，首先采用酶、水、表面活性剂、有机溶剂、单体或预聚物、以及交联剂等构建微乳体系，然后加入少量的反应底物诱导出酶活性构象，通过加热、紫外光照或直接辐射等方式引发自由基聚合反应，实现酶在高度交联载体中的包埋固定化。该方法具有制备工艺简单、酶活收率高、稳定性好、适用环境范围广、制作成本低以及所制得的固定化酶机械强度大等优点。

脂肪酶是一类特殊的酰基水解酶。作为工业用酶，加强酶稳定性和使用寿命方法之一的固定化受到了广泛的关注。商业化树脂或多孔材料（如MCM-41）作为固定化的载体一直以来都被广泛研究，但价格相对昂贵，限制了其大规模的应用，而Fe3O4纳米磁性粒子廉价易得，制备工艺简单，克服了其他固定化酶载体的缺点[11]，越来越受到广大科研工作者的重视。

在对载体的活化过程中，戊二醛（GA）、碳二亚胺（EDC）和N，N" -二环己基碳酰亚胺（DCC）是最常用的功能试剂， GA通过形成席夫碱的形式偶联载体和酶分子上的氨基，后两者则可以通过缩合反应使酶氨基和载体羧基直接偶联形成肽键，适用于带羧基和带氨基的载体[12]。

可见，固定化酶的应用前景十分广阔，固定化酶有许多优点，尤其是稳定性和可重复使用性使其在许多领域得到广泛应用。固定化酶技术是一门交叉学科技术，目前已得到长足的应用和发展，也受到越来越多人的关注。

参考文献

[1]刘薇，白姝，孙彦.磁性纳米粒子的制备及脂肪酶的固定化.过程工程学报：2004，8（4）.

[2]肖海军，贺筱蓉.固定化酶及其应用研究进展[J].生物学通报.2001，07：12-13

[3]曹树辉.基于磁性微粒的莱克多巴胺检测和DNA纯化方法的建立[D].中国优秀硕士学位论文全文数据库：2007，7.

[4]吴可兰，张爱茜等.纳米Fe3O4的制备及其对对硝基甲苯的催化降解，污染防治技术：2007，12（6）.

[5]邱广亮，张艳茹.磁性载体用于酶固定化方面的研究.内蒙古师大学报：1998，27（2）：129-139.

[6]罗贵民.北京：化工工业出版社，2002：40-45.

[7]李文章，李洁等.超顺磁性Fe3O4纳米颗粒的制备及修饰.中国期刊全文数据库：2007，（08）.

[8]桂维玲.磁场中磁液微粒超顺磁性稳定混悬的临界尺寸.北京理工大学学报：2008.9（9）.

[9]虞和慈，刘光荣等.一种新的固定化酶方法--微粒明胶吸附交联青霉酰化酶，中国抗生素杂志：1988，（03）.