黄尾鲴不同组织中LDH同工酶的研究

2022-05-15 19:05:03 | 浏览次数：

材料方法

1.1试验材料

试验用鱼为杭州市农业科学研究院保存的采集自钱塘江、福建清流以及湖南醴陵等地的黄尾鲴，未分雌雄，体重在50～150 g，每2尾制备同工酶混合样品，重复3次。

1.2试验方法

1.2.1同工酶的提取。

将鱼解剖，取肝、肾、心、眼等组织，PBS冲洗去除血渍，按体积比1∶4加入提取缓冲液（0.05 mol/L pH 6.8 Tris-HCL缓冲液），冰上用玻璃匀浆器进行组织匀浆后，转入1.5 mL离心管，4 ℃ 9 755 r/min离心30 min，吸取上清液至新的离心管中，-20 ℃保存。

1.2.2电泳及染色。

采用不连续聚丙烯酰胺非变性凝胶垂直电泳，进行乳酸脱氢酶（LDH）同工酶分析，电泳及染色方法参照国标方法进行[7]。浓缩胶浓度为3.75%，pH 6.8，分离胶浓度为6.5%，pH 8.8。每个加样槽加样5 μL（样品上样液∶5×上样缓冲液=4∶1），200 V恒压电泳5～6 h。

1.2.3结果记录。

凝胶经染色、固定后置Gel DocTM XR+凝胶成像分析系统（美国 BIO-RAD公司）进行拍照及图谱扫描。根据胶片绘制模式图，扫描数据用SPSS 13.0 for Windows 软件进行分析。

1.2.4同工酶命名及分析。

同工酶的缩写、基因座位和等位基因的命名基本参照Shakelee等[8]和Whitmore[9]的方法，即以同工酶名称缩写的大写代表酶蛋白，小写代表编码基因。控制同一种酶的不同基因座位据其相对迁移率Rf由大到小依次编号为1、2、3……，酶带分析参考熊全沫[10-11]的方法。

2结果与分析

2.1不同组织LDH同工酶谱的表达特性对黄尾鲴4种组织LDH同工酶的PAGE电泳图谱及其相应的模式图进行分析，结果显示，酶谱的表达具有明显的组织特异性：在4种组织中共检测到 14条带，从阳极端到阴极端依次编号为LDH-1、LDH-2、LDH-3、LDH-4、LDH-5、LDH-6、LDH-7、LDH-8、LDH-9、LDH-10、LDH-11、LDH-12、LDH-13和LDH-14，心和肾7条带，眼6条带，肝14条带，其中，LDH-2、LDH-3、LDH-5、LDH-6和LDH-7在心、肾和眼中均有表达，且各酶带迁移率非常相似，仅不同组织的酶带活性强弱不同。眼中未检测到LDH-8，而在其他组织中均有表达。在PAGE胶趋向阴极侧检测到6条肝所特有的酶带：LDH-9、LDH-10、LDH-11、LDH-12、LDH-13和LDH-14。此外，与其他组织相比，肝中缺失LDH-4酶带，但特有LDH-1酶带。

2.2不同组织LDH同工酶相对百分含量

利用凝胶成像分析系统对各组织LDH同工酶进行酶谱扫描及百分比分析，结果见图2和3。由图2和3可知，心中LDH-2、LDH-3和LDH-5表达占优势，肾中LDH-2、LDH-7和LDH-3表达占优势，肝中LDH-13、LDH-9和LDH-12表达占优势，眼中LDH-5、LDH-2和LDH-7表达占优势。对于典型的由A、B 2个亚基组成的4聚体LDH的5条谱带的电泳图，可以对组成A、B亚基的表达优势进行分析，但由于黄尾鲴各组织中LDH均未表现为典型的5谱带的电泳图谱，对亚基分析比较困难。

3讨论

3.1黄尾鲴LDH同工酶酶谱分析

关于黄尾鲴LDH同工酶的研究已有报道，最早见于朱蓝菲[5]的研究，朱蓝菲[5]研究结果表明，黄尾密鲴的心、肾和晶状体等组织LDH均由3条谱带组成。朱蓝菲等[3]进一步探讨了鲤科鱼类LDH同工酶的表型差异并指出眼（晶状体）的LDH同工酶较稳定，能代表各种鱼的LDH表型。曹丽琴等[12]研究中国鲴亚科鱼类同工酶和骨骼特征及系统演化，结果显示，肝LDH同工酶谱带较多，肾脏、眼睛、脑及心脏等组织均由5条谱带组成。杨品红等[13]研究了与黄尾鲴分类地位相近的细鳞斜颌鲴的LDH同工酶，指出细鳞斜颌鲴脑、肾、心和眼4种组织中LDH同工酶只有3条LDH谱带，而肝中有7条带，肌肉中有1条超显性带。

在该试验过程中发现，黄尾鲴肝、肾及心等组织中LDH同工酶的谱带较多且电泳图谱不稳定，尤其是肝组织的LDH电泳图谱。造成同工酶酶谱差异的原因，一方面可能是由于在同一种鱼不同组织中酶的编码基因（如A和B）不是同时表达，造成组织之间酶谱带数量的不同；另一方面，即使编码基因同时表达，但编码基因活性表现程度不同，或者基因表达后由于各种组织执行不同生理功能，酶受到不同因子的调控，造成各组织间同工酶含量或活性的差异，因而形成酶谱带强弱的差异[14]。此外，杂蛋白的存在及样品制备、保存等问题，也是造成同工酶酶谱差异的原因。相对于其他组织，眼（晶状体） LDH的谱带则相对较稳定，多次重复试验结果未见差异。但眼（晶状体）LDH同工酶谱带不同于已报道文献[3，12]由5条谱带组成，是由6条谱带组成。试验样品送农业部淡水鱼类种质监督检验测试中心（武汉）复检，结果显示，黄尾鲴眼LDH同工酶谱带由6条谱带组成，且肝、心和肾等组织LDH酶谱与该试验结果基本一致。由此可知，LDH同工酶在各组织中表达稳定性存在差异，且由于样品制备、处理等差异，造成试验结果差异。但相对于其他组织，眼（晶状体） LDH的谱带则相对较稳定，可以作为种质鉴定的特征之一。

3.2黄尾鲴LDH同工酶特异谱带分析

鱼类LDH同工酶中常检测到特异带，如粗唇鮠[15]酶谱A3B1处存在一条同分异构体，锦鲤和红鲤[16]的肌肉中LDH-B基因位点出现新的等位基因LDH-B′，但变异最大的是C带。一般认为，C带是由LDH-C或LDH-X[17]编码。C带变异主要体现在3个方面[13]：表达的部位；在PAGE胶中的显带部位；C带表达

条数。该试验中，在PAGE胶趋向阴极侧检测到6条肝所特

有的酶带：LDH-9、LDH-10、LDH-11、LDH-12、LDH-13和LDH-14。推测是编码区产生了LDH-C的新等位基因LDH-C′，或者LDH-C和LDH-A或LDH-B形成了杂合四聚体。此外，在黄尾鲴各组织中未发现LDH同工酶酶谱的5条典型酶带，可能是LDH-A或LDH-B产生了同分异构体，其原因有待于进一步研究。

参考文献

[1]

陈马康，童合一，俞泰济，等.钱塘江鱼类资源[M].上海：上海科学技术文献出版社，1990.

[2] 胡能书，万国贤.同工酶技术及其应用[M].长沙：湖南科学技术出版社，1985：37-62.

[3] 朱蓝菲，陈箱粦，王祖熊.20种鲤科鱼类同工酶的表型分析及有关进化问题的探讨[J].水产学报，1983，7（2）：145-152.

[4] 吴力钊，王祖熊.白鲢个体发育过程中同工酶基因的表达与调控研究[J].水生生物学报，1997，21（1）：49-58.

[5] 朱蓝菲.几种鲤科鱼类及杂种乳酸脱氢酶的比较[J].水生生物学集刊，1982，7（4）：537-545.

[6] 余毅，吴宝华.白鲢疯狂病鱼几种组织乳酸脱氢酶同工酶酶谱分析[J].鱼类病害研究，1991，13（1）：4-6.

[7] 李思发，赵金良，徐忠法，等.《养殖鱼类种质检验第13部分：同工酶电泳分析》：GB/T 18654.13-2008[S].北京：中国标准出版社，2008.

[8] SHAKLEE J B，ALLENDORF F W，MORIZOT D C，et al.Gene nomenclature for proteincoding loci in fish[J].Trans Am Fish Soc，1990，119：2-15.

[9] WHITMORE D H.Electrophoretic and isoelectric focusing techniques in fisheries management [M].CRC Press，1990.

[10] 熊全沫.鱼类同工酶酶谱分析：上[J].遗传，1992，14（2）：41-44.