超高效液相色谱法对罗非鱼中3种氟喹诺酮类兽药残留的测定

摘要 建立了罗非鱼肉中3种氟喹诺酮类兽药残留的定量分析方法。方法以乙腈-磷酸二氢钾溶液（3∶1，v/v）为提取溶剂，提取液过固相萃取小柱BOND ELUT-C18净化，3种目标化合物采用超高效液相色谱—荧光检测器检测，外标法定量。添加0.005～0.100 mg/kg浓度水平时，罗非鱼中3种氟喹诺酮类加标回收率在84%～93%，相对标准偏差（RSD）为3.9%～6.7%。方法检出限（S/N=3）为0.7～1.6 μg/kg，定量限（S/N=10）为2～5 μg/kg。该方法前处理简单，快速有效，准确可靠，可用于水产品氟喹诺酮类兽药残留日常抽样快速检测。

关键词 超高效液相色谱；荧光检测器；氟喹诺酮残留；罗非鱼

中图分类号 O657.7+2；TS207.5 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）08-0279-02

氟喹诺酮类药物Fluoroquinolones（FQS）是近30年来迅速发展起来的一类人工合成药物，具有广谱、高效等特点。其主要用作兽药和饲料添加剂，用以预防和治疗动物疾病，在临床上使用较为广泛[1]。早在20世纪80年代，在水产养殖中就已经开始使用氟喹诺酮类药物来预防和治疗细菌性疾病。由于在水产养殖过程中使用氟喹诺酮类药物，造成了水产品中的氟喹诺酮类药物残留，增强了致病菌的耐药性，这种耐药性通过食品传递给人，使人产生难以治愈的疾病。近年来，水产品中氟喹诺酮类药物残留已经引起了广泛关注[2]。

关于氟喹诺酮类药物的检测方法研究报道，一般有高效液相色谱[3]、液相色谱-串联质谱法[4]、免疫测定法等[5]，液质联用法虽然灵敏度和准确度都较高，但成本也相对较高，不易普及；免疫测定法前处理简单，但存在假阳性高、准确率相对较低的问题。高效液相色谱荧光检测器对动物源食品中FQS药物残留进行检测，前处理方法简单，且成本较低，而在此基础上利用超高效液相色谱（UPLC），与传统的HPLC技术相比，UPLC具有更强的分离能力，大幅度地改善了液相色谱的分离度和灵敏度。UPLC可以在很宽的线速度、流速和反压下进行高效的分离工作，节省试剂，最大限度地缩短了方法检测所需的时间，受到广大用户的青睐。该方法采用UPLC对罗非鱼中3种氟喹诺酮类残留物进行测定，样品检测时间仅为8 min，大大提高了检测效率，具有操作简单、准确度高、稳定性好和低耗等优点，适合大批样品的快速测定。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

供试试剂：环丙沙星、甲磺酸达氟沙星、恩诺沙星对照品（购自Dr.Ehrenstorfer GmbH）。甲醇（德国Merck公司色谱纯）；磷酸、三乙胺（科龙化工色谱纯）；乙腈、磷酸二氢钾、氢氧化钠（广州化学试剂厂AR）。

仪器和设备：电子天平（Precisa公司）；旋涡混合器（上海精科实业有限公司XW-80A）；高速冷冻离心机（Sigma公司3-30k）；固相萃取装置12孔（美国supelco）、固相萃取柱：BOND ELUT-C18（100 mg 1 mL）；振荡床（IKA KS501digital）；超纯水系统A10（美国Millipore公司Milli-Q）；Waters超高效液相色谱仪（带荧光检测器）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品提取。称取2 g（精确到0.01 g）去磷去腮后绞碎的样品，置50 mL离心管中，用10 mL乙腈-磷酸盐缓冲溶液（3∶1，v/v）旋涡混合分散成糊状，中速振荡5 min，10 000 r/min离心5 min，倒出上清液。残渣重复提取1次，合并上清液，混匀，备用。

1.2.2 样品净化。固相萃取柱先依次用甲醇、磷酸盐缓冲溶液各2 mL预洗。取备用液5.0 mL过柱，用1 mL水淋洗，挤干。用流动相1.0 mL洗脱，挤干，收集洗脱液。过0.22 μm滤膜，上机。

1.2.3 色谱条件。色谱条件如下：色谱柱：ACQUITY UPLCTM BEH C18柱（2.1×50 mm，1.7 μm）；流动相：0.05 mol/L磷酸溶液/三乙胺+乙腈（92+8，v/v），等度洗脱；流速：0.4 mL/min；柱温：室温；进样量10 μL；检测波长：激发波长280 nm，发射波长450 nm。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

氟喹诺酮类药物结构上有羧基和哌嗪基，具有酸碱两性。由于分子结构相似，在水溶液中呈离子的形式存在，给液相色谱分离带来一定的难度。试验方法过程中分别以pH值2.4、3.0、5.0的磷酸/三乙胺离子对试剂为流动相观察3种氟喹诺酮类药物的分离情况。试验发现以pH值5.0的磷酸/三乙胺作为流动相在ACQUITY UPLCTM BEH C18柱（1.7 μm，2.1×50 mm）能将3种氟喹诺酮类药物色谱峰分开。加入三乙胺有效地防止了色谱峰拖尾，峰形对称。而pH值2.4、3.0的磷酸/三乙胺溶液作为流动相使达氟沙星和恩诺沙星无法达到基线完全分离，影响定性定量。因此，选择pH值5.0的磷酸/三乙胺溶液与乙腈（92+8，v/v）作为流动相，3种氟喹诺酮类药物在8 min内全部出峰，分离良好，具体结果图1所示。

2.2 提取溶剂的选择

氟喹诺酮类药物具有酸碱两性，易溶于酸性或碱性溶剂。纯溶剂乙腈提取，蛋白质易沉淀，杂质较少，但其回收率比较低。磷酸盐提取，杂质较多，提取液离心后无法澄清，净化过柱时比较困难，影响回收率且浪费检测时间。该方法采用经NaOH调节pH值为7.0的乙腈-磷酸二氢钾溶液（3∶1，v/v）为提取液。提取液含水量少，溶剂易浓缩挥干，提高乙腈的比例使蛋白质易沉淀，净化过柱时间较短，提高检测回收率。

2.3 样品净化方式的选择

水产品中含有大量的脂肪、蛋白质等大分子物质，试样提取液呈浑浊状态，若采用正己烷对提取液进行净化萃取能有效去除提取液中的脂肪、蛋白质。有关报道[6-10]指用这一方法来代替固相萃取小柱能简化试验步骤，降低检测成本。但该方法采用UPLC色谱柱只有1.7 μm，提取液未经处理会堵塞色谱柱，影响色谱柱使用寿命。而采用C18固相萃取小柱对目标物进行富集洗脱、浓缩后检测，去掉了杂质的干扰，提高了回收率。

2.4 方法标准曲线、检出限及定量限

将不含待测物的罗非鱼组织空白基质溶液稀释标准品，分别配制环丙沙星、恩诺沙星浓度为5、10、20、50、100 μg/L和达氟沙星浓度为 1、2、4、10、20 μg/L的标准品。在1.2.3色谱条件下进行测定，以峰面积为y值，标准溶液浓度为x值进行线性回归，求得线性方程。以3倍信噪比（S/N）确定分析物的检出限，10倍信噪比（S/N）确定定量限。回归方程、相关系数以及定量限如表1所示。

2.5 回收率与精密度

在空白基质鱼肉中添加一定量的氟喹诺酮类药物混合标准溶液，每个添加浓度重复测定6次，同时做空白试验，其结果如表2所示。可以看出，3种氟喹诺酮类药物添加回收率是84%～93%，相对标准偏差3.9%～6.7%。说明方法具有较好的精密度和回收率，可以满足兽药残留的痕量分析要求。

3 结论与讨论

鱼肉成分复杂，对其进行微量氟喹诺酮类药物的检测存在一定干扰。该方法通过对提取溶剂的选择和优化、固相萃取净化以及UPLC测定条件选择，成功建立了用超高效液相色谱同时测定环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星3种氟喹诺酮类药物残留量的方法。与传统液相色谱法相比，该方法上机时间大大缩短，明显提高了工作效率。样品的前处理操作简便，溶剂用量少，萃取速度快，省时省力。该方法的灵敏度和精密度可以满足实际样品检测需要，适用于鱼肉中3种氟喹诺酮类兽药残留含量的测定，尤其适合大批量样品的快速检测[11-16]。

4 参考文献

[1] 陈丽，杨长志，刘永，等.高效液相色谱法同时测定水产品中多种氟喹诺酮类药物残留量[J].化学工程师，2009（9）：25-27.

[2] 惠芸华，张晓玲，金高娃，等.高效液相色谱法测定水产品中9种氟喹诺酮类药物残留[J].海洋渔业，2010，32（2）：204-210.

[3] 陈辉华，戴军，王洪新，等.HPLC法对鱼肉中3种四环素类和5种氟喹诺酮类兽药残留的同时测定[J].分析测试学报，2008，27（9）：951-955.

[4] 刘媛，谢孟峡，丁岚，等.高效液相色谱同时测定鸡蛋中4种氟喹诺酮类药物残留[J].分析化学，2004，32（3）：352-355.

[5] LISIANE S E，ELFRIDES E S S.Microbiological Assay for Determination of floxacin Injection[J].Jourmal of Pharmaceutical and Bio-medical Ana-lysis，2002（3）：91-96.

[6] 潘媛，牛华，程晓云，等.动物源性食品中六种氟喹诺酮类残留检测前处理的优化[J].中国兽药杂志，2011，45（4）：28-32.

[7] 丁国华，丁磊如，刘霞，等.氟喹诺酮类药的神经毒性作用[J].中国医院药学杂志，1995，8（15）：380-384.

[8] 李振华，魏东，张乃生.氟喹诺酮类药物残留检测方法研究进展[J].动物医学进展，2007，28（3）：98-101.

[9] 彭涛，雍炜，安娟，等.反相高效液相色谱/质谱法同时测定鸡肉中5种喹诺酮药物残留[J].分析化学，2006（34）：S10-S14.

[10] 王蕊，廖晓萍，刘雅红.氟喹诺酮类兽药残留检测方法研究进展[J].广东农业科学，2010（10）：41-43.

[11] 李星如，毕凤兰.浅析氟喹诺酮类药物的安全性现状[J].中国药物警戒，2013，10（1）：44-46.

[12] 丑亚琴，唐巍，卢艳芬，等.高效液相色谱法同时测定水产品中四种氟喹诺酮类药物残留前处理条件的优化[J].水产养殖，2013（1）：21-27.

[13] 吴春燕，陈娟，李敏，等.高效液相色谱法测定银翘散中3种氟喹诺酮类药物试验[J].中国畜牧兽医文摘，2012（8）：25-27.

[14] 单乃荣，何琼，余莲，等.液相色谱法测定饲料中氟喹诺酮类含量方法研究[J].广西农学报，2012，27（4）：51-55.

[15] 谭美英，隆雪明，邓云波，等.高效液相色谱法测定饲料中氟喹诺酮类药物[J].饲料工业，2012（21）：52-53.

[16] 刘艳辉，祖岫杰，李改娟，等.氟喹诺酮类药物对鱼类常见病病原菌的抑菌试验[J].吉林水利，2012（10）：35-36，46.